微生物染色的基本原理，是借助物理因素和化學(xué)因素的作用而進(jìn)行的。物理因素如細(xì)胞及細(xì)胞物質(zhì)對(duì)染料的毛細(xì)現(xiàn)象、滲透、吸附作用等?；瘜W(xué)因素則是根據(jù)細(xì)胞物質(zhì)和染料的不同性質(zhì)而發(fā)生地各種化學(xué)反應(yīng)。酸性物質(zhì)對(duì)于堿性染料較易吸附，且吸附作用穩(wěn)固；同樣，堿性物質(zhì)對(duì)酸性染料較易于吸附。如酸性物質(zhì)細(xì)胞核對(duì)于堿性染料就有化學(xué)親和力，易于吸附。但是，要使酸性物質(zhì)染上酸性材料，必須把它們的物理形式加以改變（如改變pH值），才利于吸附作用的發(fā)生。相反，堿性物質(zhì)（如細(xì)胞質(zhì)）通常僅能染上酸性染料，若把它們變?yōu)檫m宜的物理形式，也同樣能與堿性染料發(fā)生吸附作用。

常用染色法

單染色法

只用一種染料染色。由于大多數(shù)細(xì)菌胞漿內(nèi)含有酸性物質(zhì)，可與堿性染料結(jié)合，故常用呂氏美藍(lán)、結(jié)晶紫和稀釋石碳酸復(fù)紅等染液。此法可觀察細(xì)菌的大小、形態(tài)與排列，不能顯示細(xì)菌的結(jié)構(gòu)與染色特性。

2.復(fù)染色法

用兩種或兩種以上不同染料可將細(xì)菌染成不同的顏色，除可觀察細(xì)菌的大小、形態(tài)與排列外，還反應(yīng)出細(xì)菌染色特性，具有鑒別細(xì)菌種類的價(jià)值。常用的有革蘭染色法和抗酸染色法。

(1)革蘭染色：①細(xì)菌涂片經(jīng)火焰固定，加結(jié)晶紫染液染1min，清水沖去染液。②加碘液媒染 1min，水洗，甩干。③用95%乙醇脫色，輕輕搖動(dòng)約30s，至無(wú)紫色洗落為止，水洗，甩干。④加稀釋石碳酸復(fù)紅或沙黃染液數(shù)滴進(jìn)行復(fù)染，約30s，水洗。⑤干后顯微鏡下鏡檢觀察結(jié)果，革蘭陽(yáng)性菌染成紫色，革蘭陰性菌為紅色。

(2)抗酸染色：萋-尼 (Ziehl-Neelse)抗酸染色法：

①細(xì)菌涂片經(jīng)火焰固定，加石炭酸復(fù)紅溶液，徐徐加熱至有蒸氣出現(xiàn)，切不可沸騰。染液因蒸發(fā)減少時(shí)，應(yīng)隨時(shí)補(bǔ)充，防止染液蒸干。持續(xù)染5min(奴卡菌需要加長(zhǎng)時(shí)間)，水洗，甩干。

②滴加3%鹽酸乙醇脫色，不時(shí)搖動(dòng)玻片至無(wú)紅色脫落為止，水洗，甩干。

③加呂氏美藍(lán)復(fù)染液數(shù)滴復(fù)染1min，水洗。

④干后顯微鏡下鏡檢觀察結(jié)果，抗酸桿菌染成紅色，非抗酸桿菌為藍(lán)色。

金胺O-羅丹明B染色法：①細(xì)菌涂片固定后加第1液30——90s。②棄去第1液后加第2液染15min。③用第3液脫色1——2min，水洗。④滴加第4液染30s，水洗，

⑤干后置熒光顯微鏡下鏡檢觀察結(jié)果 在淡藍(lán)色背景下，抗酸桿菌呈紅色，其它細(xì)菌和細(xì)胞呈藍(lán)色。

3.特殊染色法

(1)鞭毛染色(改良Ryu法)：

①玻片的處理 將新載玻片浸泡在95%乙醇中。臨用時(shí)取出，以干凈紗布擦干。

②在玻片上滴蒸餾水1滴。

③挑取培養(yǎng)物少許，輕觸蒸餾水滴頂部，僅允許極少量細(xì)菌進(jìn)入水滴，不可攪動(dòng)，以免鞭毛脫落。④置35℃孵箱自然干燥，不能用火焰固定，滴加鞭毛染液染1——2 min輕輕水洗。

⑤干后顯微鏡鏡檢觀察結(jié)果 鞭毛和菌體呈紫色。

(2)異染顆粒染色(阿爾培托法)：

①細(xì)菌涂片經(jīng)火焰固定，加甲液染色3——5min。水洗。

②滴加乙液，染1min。水洗。

③干后顯微鏡鏡檢觀察結(jié)果 菌體呈綠色，異染顆粒呈藍(lán)黑色,用于白喉棒狀桿菌染色。

(3)莢膜染色：

①奧爾特莢膜染色法：將已固定的細(xì)菌涂片滴加3%沙黃染液，用火焰加溫染色，持續(xù)3min，冷卻后水洗，待干鏡檢。結(jié)果：菌體呈褐色，莢膜呈黃色，此法主要用于碳疽芽胞桿菌。

②Hiss氏硫酸銅法：染液：第一液為結(jié)晶紫乙醇飽和液5ml加蒸餾水95ml 的混合液;第二液為20%硫酸銅水溶液。方法：細(xì)菌涂片自然干燥，乙醇固定。滴加第一液，微加熱染1min。再用第二液將涂片上的染液洗去，勿再水洗，傾去硫酸銅液，以吸水紙吸干鏡檢。結(jié)果：菌體及背景呈紫色，莢膜呈鮮藍(lán)色或不著色。

(4)芽胞染色：

染液：第一液為萋-納氏石炭酸復(fù)紅液，第二液為95%乙醇，第三液為堿性美藍(lán)液。

方法：將已固定的細(xì)菌涂片滴加第一液，微加熱染5min，冷卻后水洗。用第二液脫色2min，水洗。加第三液復(fù)染1min，水洗，待干鏡檢。結(jié)果：菌體呈藍(lán)色，芽胞呈紅色。

4.負(fù)染色法

背景著色而菌體本身不著色的染色為負(fù)染色法。最常見的是墨汁負(fù)染色法，用來觀察真菌及細(xì)菌莢膜等。在標(biāo)本涂片處滴加染液，混合后加上蓋玻片(勿產(chǎn)生氣泡)，輕壓。在低倍鏡下尋找有莢膜的菌細(xì)胞，轉(zhuǎn)高倍鏡或油鏡確認(rèn)，如新型隱球菌可見寬厚透亮的莢膜，背景為黑色。

5.熒光染色法

經(jīng)熒光素染色的細(xì)菌，或熒光素標(biāo)記的熒光抗體與相應(yīng)抗原的細(xì)菌、病毒結(jié)合形成的復(fù)合物，在熒光顯微鏡下發(fā)出熒光。

細(xì)菌染色的一般程序

細(xì)菌染色的一般程序是：涂片(干燥)—固定—染色(媒染)—(脫色)—(復(fù)染)。

涂片制備

血液、分泌物、排泄物、穿刺液和液體培養(yǎng)物，直接在載玻片上作薄膜涂片;尸檢或感染動(dòng)物組織，病變局部涂抹采樣的棉拭子直接涂片。固體培養(yǎng)基上的菌落或菌苔的制片，先用接種環(huán)取一環(huán)生理鹽水置載玻片中央，再用無(wú)菌接種環(huán)取少量的培養(yǎng)物在生理鹽水中磨勻，涂布成1cm2大小的涂面，置室溫下自然干燥或遠(yuǎn)火慢慢烘干。

2.固定

目的是殺死細(xì)菌，凝固細(xì)菌蛋白及結(jié)構(gòu)，便于染色;促使細(xì)菌粘附在載玻片上，避免在水洗過程中被水沖掉;改變細(xì)菌對(duì)染料的通透性，有利于菌細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的染色。通常用火焰加熱固定，將已干燥的涂片在火焰中迅速通過3次，以手背皮膚接觸玻片不燙為佳。

3.染色

根據(jù)檢驗(yàn)?zāi)康牟煌x擇不同的染色方法進(jìn)行染色。染色時(shí)滴加染液，以復(fù)蓋標(biāo)本為度。

4.媒染

凡能增強(qiáng)染料和被染物的親和力，使染料固定于被染物及能引起細(xì)胞膜通透性改變的物質(zhì)，稱媒染劑。常用的有明礬、鞣酸、金屬鹽和碘等，也有用加熱法促進(jìn)著色。媒染劑可用于初染與復(fù)染之間，也可用于固定之后或含于固定液、染色中。

5.脫色

凡能使已著色的被染物脫去顏色的化學(xué)試劑稱為脫色劑。常用乙醇、丙酮等作為脫色劑。脫色劑可以查出細(xì)菌與染料結(jié)合的穩(wěn)定程度，作為鑒別染色之用。

6.復(fù)染

已脫色處理的細(xì)菌或其結(jié)構(gòu)常以復(fù)染液作復(fù)染以便于觀察。復(fù)染液與初染液的顏色不同而成一鮮明對(duì)比。復(fù)染不宜太強(qiáng)，以免掩蓋初染的顏色。

主要用于厭養(yǎng)菌動(dòng)力的檢查。通常選用60——70mm長(zhǎng)。0.5——1.0mm孔徑的毛細(xì)管虹吸厭養(yǎng)菌懸液后，用火焰將毛細(xì)管兩端熔封。并用塑膠紙將毛細(xì)管固定在載玻片上，置高倍鏡下暗視野觀察。