概念

EMSA 稱凝聚阻滯實(shí)驗(yàn)或凝膠電泳遷移率檢測， 是一種用于研究轉(zhuǎn)錄因子和其相關(guān)的 DNA 結(jié)合序列相互作用的技術(shù)，能對各類轉(zhuǎn)錄因子的 DNA 結(jié)合活性進(jìn)行定性和半定量分析，是一項(xiàng)研究細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)技術(shù)。這一技術(shù)最初用于研究DNA結(jié)合蛋白，目前已用于研究RNA結(jié)合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。

原理

EMSA 主要基于蛋白-探針復(fù)合物在在凝膠電泳過程中遷移較慢的原理。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)特異性和非特異性探針，當(dāng)核酸探針與樣本蛋白混合孵育時(shí)，樣本中可以與核酸探針結(jié)合的蛋白質(zhì)與探針形成蛋白-探針復(fù)合物；這種復(fù)合物由于分子量大，在進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)遷移較慢，而沒有結(jié)合蛋白的探針則較快；孵育的樣本在進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉(zhuǎn)膜后，蛋白-探針復(fù)合物會在膜靠前的位置形成一條帶，說明有蛋白與目標(biāo)探針有互作。

分類

同位素標(biāo)記探針

特點(diǎn)：特異性強(qiáng)、敏感性高達(dá)到10-18mol水平，對操作人員身體有害

非同位素標(biāo)記探針------應(yīng)用最為廣泛

特點(diǎn)：無需放射顯影，采用生物發(fā)光或化學(xué)發(fā)光原理。靈敏度高，信號強(qiáng)

EMSA的特異性

常用實(shí)驗(yàn)技術(shù)中免疫組化、免疫印跡 ( WesternBlotting) 和 EMSA 均可用于轉(zhuǎn)錄因子檢測，但三者的側(cè)重點(diǎn)各有不同。免疫組化或免疫熒光技術(shù)可以較準(zhǔn)確的反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)部位和表達(dá)細(xì)胞， Western Blotting 可以精確定量轉(zhuǎn)錄因子。但并非所有轉(zhuǎn)錄因子均可以與 DNA 結(jié)合以刺激基因轉(zhuǎn)錄，唯有 EMSA 技術(shù)可以反映轉(zhuǎn)錄因子是否具有 DNA 結(jié)合活性，故 EMSA 是證明細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路最終效應(yīng)的必要實(shí)驗(yàn)技術(shù)。

實(shí)驗(yàn)步驟（步驟來源與網(wǎng)絡(luò)僅供參考）

探針的標(biāo)記

①:探針標(biāo)記的反應(yīng)體系(1.75pmol/μl) 2μl

T4 Polynucleotide Kinase Buffer (10X) 1μl

Nuclease-Free Water 5μl

[γ-32P]ATP (3,000Ci/mmol at 10mCi/ml) 1μl

T4 Polynucleotide Kinase (5-10u/μl) 1μl

總體積 10μl

②:使用水浴或PCR儀37℃反應(yīng)10min.

③:加一定體積的終止液、混勻、終止探針標(biāo)記.

④:加入一定體積的TE、混勻.

探針的純化(視情況定）

對于100μl標(biāo)記好的探針，加入一定量的醋酸銨和無水乙醇

在-70℃沉淀1h或在-20℃沉淀過夜

在4℃12000g-16000g 離心30min 棄上清

在4℃12000g-16000g 離心1min、吸去殘余液體

加入一定體積的 TE ,使沉淀溶解

探針使用時(shí)間一般不超過3天，保存在-20℃

實(shí)驗(yàn)中常見的問題：

1、為什么看不到遷移帶？

1）蛋白樣本提取質(zhì)量不高，蛋白降解或者提取量不足。

2）樣本中沒有可以與探針結(jié)合的蛋白。

3）探針與蛋白無特異性的相互作用。

4）轉(zhuǎn)膜效率低，蛋白或者探針未轉(zhuǎn)移到膜上。

5）曝光或者成像時(shí)間過短。

6) 在 Super-Shift EMSA 測定中看不到 Super-Shift DNA/蛋白復(fù)合物帶還可能有以下原因：

a. 抗體沒有工作。不是所有的抗體都可以用于 Super-Shift EMSA，只有對非變性蛋白的表面抗原決定簇起反應(yīng)的抗體才能夠用于 Super-Shift EMSA。

b. 測定的活化的 DNA/蛋白復(fù)合物中沒有希望檢測的構(gòu)成成分存在。此時(shí)既看不到 Super-Shift 的帶，也看不到 DNA/蛋白復(fù)合物的量的減少。

c. 使用的抗體過度稀釋。一般 10～20 ul 的反應(yīng)液需要使用 0.5～1 ul 原倍的抗體。

d. 多抗與 DNA/蛋白復(fù)合物形成大的聚集物而不進(jìn)膠。在這種情況下，雖然看不到 Super-Shift 的帶，但應(yīng)當(dāng)可以看到 DAN/蛋白復(fù)合物的電泳帶明顯減少。

2、為什么實(shí)驗(yàn)背景高？

1）曝光或者成像時(shí)間過長。

2）封閉時(shí)間不足或者效率不高。

3）洗滌效果不佳。

4）實(shí)驗(yàn)過程中膜沒有一直處于濕潤狀態(tài)。

3、EMSA 測定需要多少量的蛋白與標(biāo)記的探針？

對每一個(gè)特定的結(jié)合蛋白和探針，所用的純化蛋白，部分純化蛋白，粗制核抽提液需作優(yōu)化：一般所用純化蛋白的量在 20～2 000 ug 間，用粗制核抽提液，需要 2～10 ug 蛋白形成特異的復(fù)合物。部分純化蛋白與粗制核抽提液應(yīng)保存在 -80 ℃、探針應(yīng)保存在 -20 ℃ 以防止降解。

無論探針或是結(jié)合蛋白都應(yīng)避免多次凍融。

4、用什么凝膠條件將蛋白質(zhì)/探針復(fù)合物和游離的探針分離開？

將結(jié)合蛋白或粗制核抽提液和目的探針結(jié)合，蛋白/探針復(fù)合物和游離探針可在非變性聚丙烯酰胺凝膠中經(jīng)電泳分離。聚丙烯酰胺的濃度一般為 6%，在特定條件下可用高或低的濃度。也可將 TGE 緩沖液（12.5 mM Tris，pH8.3，95 mM 甘an酸，0.5 mM EDTA）用于不穩(wěn)定的蛋白/DNA 復(fù)合物。在 4 ℃ 進(jìn)行結(jié)合和電泳實(shí)驗(yàn)以阻止不穩(wěn)定復(fù)合物和探針的解離。

5、Poly(dI:dC)，非特異性競爭 DNA，特異性競爭 DNA 在 EMSA 測定中的作用？

Poly(dI:dC) 由肌ji苷和胞嘧啶組成。在 EMSA 反應(yīng)中加入 poly(dI:dC)，可抑制粗制核抽提液中轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子與標(biāo)記探針的非特異結(jié)合。結(jié)合溶液中的 poly(dI:dC) 的用量需在正式實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行優(yōu)化，一般用量大約在 0.05 mg/ml 左右。當(dāng)用純化的蛋白作凝膠遷移反應(yīng)時(shí)，不必一定加入 poly(dI:dC)，如加入，則普通反應(yīng)中所用終濃度不超過 50～100 ug。對核抽提液，每 2～3 ug 核抽提液用 1 ug poly(dI:dC)。