01、PCR產(chǎn)物的電泳檢測時間
一般為48h以內(nèi)，有些最好于當(dāng)日電泳檢測，大于48h后帶型不規(guī)則甚致消失。

02、假陰性，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶
PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備②引物的質(zhì)量與特異性③酶的質(zhì)量及活性 ④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。

一、模板
1、模板中含有雜蛋白質(zhì)
2、模板中含有Taq酶抑制劑
3、模板中蛋白質(zhì)沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白
4、在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚
5、模板核酸變性不徹di底。在酶和引物質(zhì)量好時，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改。

二、酶失活
需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。

三、引物
引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴(kuò)增，對策為：
①選定一個好的引物合成單位。
②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。
③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。
④引物設(shè)計不合理，如引物長度不 夠，引物之間形成二聚體等。

四、Mg2+濃度
Mg2+離子濃度對PCR擴(kuò)增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴(kuò)增的特異性，濃度過低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。

五、反應(yīng)體積的改變
通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20ul、30ul、50ul.或100ul，應(yīng)用多大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul后，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。

六、物理原因
變性對PCR擴(kuò)增來說相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現(xiàn)假陰性；退火溫度過低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。有時還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計，檢測一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。

七、靶序列變異
如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其PCR擴(kuò)增是不會成功的。

03、假陽性
出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。

一、引物設(shè)計不合適
選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計引物。

二、靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染
這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽性。
這種假陽性可用以下方法解決：
①操作時應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外。
②除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或 器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。
③必要時，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇樱c引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。

04、出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶
PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不wan全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。
其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。

其對策有：
①必要時重新設(shè)計引物。
②減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。
③降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。
④適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法(93℃變性，65℃左右退火與延伸)。
出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶
PCR擴(kuò)增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。

其對策有：
①減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶。
②減少dNTP的濃度。
③適當(dāng)降低Mg2+濃度。
④增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。

當(dāng)PCR結(jié)果不甚滿意時，首先檢查以下幾方面并遵照執(zhí)行：
1、將PCR反應(yīng)的試管與反應(yīng)板緊貼。
2、當(dāng)酶反應(yīng)混合物以70℃“熱啟動"開始循環(huán)時，切記在加入酶后稍微振蕩一下，因為在0.2-ml的PCR管中不能均勻傳熱。
3、不要隨意減少dNTP的用量，它是一個系統(tǒng)的因素，必須與其它成份保持平衡。
4、對于有問題的PCR反應(yīng)，例如模板的量少，模板不純和環(huán)狀模板等，先嘗試加Taq酶前的體系進(jìn)行預(yù)變性，后加模板進(jìn)行正常PCR擴(kuò)增。

沒有擴(kuò)增產(chǎn)物：
1、在提供MgCl 2 緩沖液中，以0.25mmol/L為梯度增加MgCl 2 濃度；無MgCl2的緩沖液以0.5 mmol/L為梯度增加MgCl2濃度。
2、泳道中出現(xiàn)模糊條帶，如果DNA模板中存在RNA，則按上述提示濃度補(bǔ)加MgCl 2 ，因為在PCR反應(yīng)中可能缺少游離的Mg 2+ 。
3、檢查退火溫度和變性條件，如果有需要的話，可降低退火溫度。
4、檢查模板和引物的用量。
5、增加循環(huán)次數(shù)和/或模板DNA的用量。

泳道中出現(xiàn)模糊條帶：
1、減少循環(huán)次數(shù)或模板DNA的用量。
2、提高退火溫度，但不要超過68℃。
3、重新設(shè)計引物或設(shè)計更長的引物。

其他值得注意的條件：
1、建議使用0.2-ml薄壁管。厚壁管在92℃時不能有效地使模板變性。
2、最佳反應(yīng)體積為50ml，推薦用30ml礦物油覆蓋（對蓋子加熱的PCR儀可以不加）。
3、大多數(shù)反應(yīng)中，0.75ml（0.5~1ml）的酶量在大多數(shù)情況下可以得到滿意的結(jié)果。
4、優(yōu)化Mg2+的濃度是必需的。
5、基因組DNA模板的質(zhì)量顯著影響PCR反應(yīng)。因此推薦使用瓊脂糖凝膠電泳來檢測DNA的長度。DNA片段長度可以超過50kb，傳統(tǒng)的基因組DNA能擴(kuò)增片段至10kb。
6、要擴(kuò)增更長的片段應(yīng)使用超純或高分子量的DNA。請查閱高分子量DNA提取操作過程相關(guān)文獻(xiàn)。
7、降低二級結(jié)構(gòu)和引物二聚物形成的可能性。進(jìn)行長片段PCR擴(kuò)增時，引物長度一般為24~34個核苷酸，溶點(diǎn)在60~68℃間。使用這類引物可提高PCR反應(yīng)的退火溫度來增加反應(yīng)的特異性。這點(diǎn)非常重要，長片段擴(kuò)增的效果往往受到非特異性短片段優(yōu)先擴(kuò)增的影響。
8、變性：第一步變性在94℃下進(jìn)行2分鐘。在循環(huán)過程中盡可能縮短變性時間（94℃下進(jìn)行20--30秒），除非模板中富含GC，則95℃下變性30秒。這可以防止DNA脫嘌啉和鏈斷裂，對于所需擴(kuò)增的基因組DNA片段終長度超過12 kb時，應(yīng)該盡可能的降低變性溫度。
9、延伸：68--72℃下進(jìn)行延伸操作。
10、循環(huán)延伸：盡量采用循環(huán)延伸的條件，若PCR儀無此功能，則必須增加延伸的時間，例如在擴(kuò)增10kb片斷時，延伸時間用10分鐘替代原來的8分鐘。
11、長片斷PCR系統(tǒng)擴(kuò)增的片斷其3’-末端帶有一個突出的A，因此建議采用T/A克隆。若要進(jìn)行平端可隆，可用Klenow酶和T4 DNA多聚酶將PCR產(chǎn)物補(bǔ)平后再進(jìn)行。
12、測序時因酶的混合物帶有3’→5’外切酶活性，用Sanger方法進(jìn)行測序不能產(chǎn)生均一的（染色體）帶型。

引物設(shè)計：
1、一般長度20-30bp；
2、至少50%的GC含量；
3、避免引物二聚體和二級結(jié)構(gòu)；
4、引物對的Tm值應(yīng)該接近。