聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟
點(diǎn)擊次數(shù)：1258 更新時(shí)間：2023-06-30
一、準(zhǔn)備工作
1、實(shí)驗(yàn)器具與材料：
（1）移液槍：200ul、10ul
（2）吸頭：200ul、20ul
（3）吸頭臺(tái)：放置200ul和20ul的吸頭一個(gè)
（4）EP管1.5ml、100ul
2、實(shí)驗(yàn)器具的處理與準(zhǔn)備
塑料制品：（包括吸頭、EP管等）
送至高壓3次，試驗(yàn)前將槍頭放入吸頭臺(tái)。
3、試劑配制和準(zhǔn)備：
（1） 雙蒸水： 100ml鹽水瓶?jī)?nèi)裝40ml蒸餾水，送至高壓，后分裝到幾個(gè)1。5mlEP管中，-20℃中保存?zhèn)溆谩?br/>（2） PCR中所需要的各種試劑
二、PCR時(shí)注意事項(xiàng)：
佩戴一次性手套，同時(shí)避免戴上的一次性的手套接觸可疑污染物。
三、PCR步驟
1、準(zhǔn)備100ul EP管
2、依次在管中加入：（50ul反應(yīng)體系）
ddH2O37.5ul×
10mM dNTP1ul×
10×PCR buffer5ul×
25mM MgCl2
（加之前要搖勻）3ul×
上游引物1ul×
下游引物1ul×
模板cDNA1ul
3、稍離心
4、100℃沸水浴1分鐘
5、趁熱加入Tag酶0.5ul（冰上操作）
6、再加入50ul液體石蠟封閉
7、10000rmp離心1分鐘
8、PCR條件
94℃ 1min
58℃ 50sec
72℃ 1min30sec
進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，然后72℃ 10min 完后4℃保溫。
9、10000rmp離心5min
10、將下層水相轉(zhuǎn)入新的0.65mlEP管中，－20℃保存。
