目前中國藥典、消毒技術規(guī)范中用于各種化學消毒劑、干熱、環(huán)氧乙烷、高壓蒸汽等滅菌效果的驗證和評價的芽胞懸液的獲得主要通過自制和商品化兩種途徑。

一、自制芽胞懸液

(1) 菌種處理：取凍干菌種管，在無菌操作下打開，以毛細吸管吸加適量營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，輕柔吹吸數(shù)次，使菌種融化分散。取含5～10ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基試管，滴入少許菌種懸液，置37℃培養(yǎng)18～24小時。用接種環(huán)取第1代培養(yǎng)的菌懸液，劃線接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，于37℃培養(yǎng)18～24小時。挑取上述第2代培養(yǎng)物中典型菌落，接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)18～24小時，即為第3代培養(yǎng)物。

(2) 轉(zhuǎn)種固體培養(yǎng)基：用10.0ml吸管吸取5.0～10.0ml第3～5代的18～24小時營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物，接種于羅氏瓶中營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基表面，將其搖動使菌液布滿營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的表面，再將多余肉湯培養(yǎng)物吸出，將羅氏瓶置于37℃溫箱內(nèi)，培養(yǎng)5～7天。

(3) 觀察芽胞形成：用接種環(huán)取菌樣少許涂于玻片上，固定后以改良芽胞染色法染色，并在顯微鏡(油鏡)下進行鏡檢。當芽胞形成率達95％以上時，即可進行以下處理。否則，應繼續(xù)在室溫下放置一定時間，直至達到上述芽胞形成率后再進行以下處理。

改良芽胞染色法：

①用接種環(huán)取菌樣涂布于玻片上，待自然干燥。而后通過火焰加熱將菌固定于玻片上。

②將涂片放入平皿內(nèi)，片上放兩層濾紙，滴加足量的5.0％孔雀綠水溶液。將平皿蓋好，放54℃～56℃條件下，加熱30分鐘。取出。去濾紙，用自來水沖洗殘留孔雀綠溶液。

③加0.5％沙黃水溶液，染1分鐘。水洗，待干后鏡檢。芽胞呈綠色，菌體呈紅色。

(4) 制成芽胞懸液：羅氏瓶培養(yǎng)物，用10.0ml吸管加10.0ml無菌蒸餾水于每一羅氏瓶中，以L棒輕輕推刮下菌苔。吸出第1批洗下的菌懸液，再向瓶內(nèi)吸加5.0ml無菌蒸餾水，重復洗菌一遍。將第1和第2批洗下的菌懸液集中于一含玻璃珠的無菌三角燒瓶中，振搖5分鐘，打碎菌塊，使成均勻的芽胞懸液。（注意：必要時，將盛裝菌懸液的三角燒瓶置45℃水浴中24小時，使菌自溶斷鏈。分散成單個芽胞。）

(5)純化芽胞液：用無菌棉花或紗布過濾芽胞懸液，清除其中的瓊脂凝塊。將過濾后的芽胞懸液，置無菌離心管內(nèi)，以3000轉(zhuǎn)／分速度離心30分鐘。棄上清液，加蒸餾水吹吸使芽胞重新懸浮。再離心和重新懸浮清洗，先后共3遍。將洗凈的芽胞懸浮于三角燒瓶內(nèi)蒸餾水中，并加入適量小玻璃珠。將芽胞液放于80℃水浴中10分鐘(或60℃，30分鐘)，以殺滅殘余的細菌繁殖體。待冷至室溫后，保存于4℃冰箱中備用。有效使用期為半年。

(6)芽胞懸液在使用時，應用平板法先進行活菌培養(yǎng)計數(shù)。懷疑有雜菌污染時，應以菌落形態(tài)、革蘭染色與生化試驗等法進行鑒定。

二、商品化芽胞懸液

HKM™定量芽胞懸液（菌種名稱：wei縮芽孢桿菌（曾用名：枯草芽孢桿菌黑色變種）ATCC9372）

產(chǎn)品介紹：該芽胞懸液是根據(jù)國際通用標準菌株ATCC9372，參照國家藥典、消毒技術規(guī)范、相關標準等，經(jīng)嚴格質(zhì)量控制制備而成。該菌株懸液含有一定數(shù)量的芽胞，用于自制生物指示劑應用于各種化學消毒劑、干熱、環(huán)氧乙烷等滅菌效果的驗證和評價，無菌冷灌裝生產(chǎn)線的性能驗證，染菌載體的制備以及生物安全柜滅菌效果的驗證等。也可用于直接培養(yǎng)等。