實(shí)驗(yàn)概要
本實(shí)驗(yàn)從乙醇浸泡的魚苗中提取DNA，并利用直接PCR進(jìn)行了鑒定。
實(shí)驗(yàn)原理
在實(shí)際的研究工作中，野外取樣的地點(diǎn)一旦較為偏遠(yuǎn)，受條件的限制，很難保證得到的樣品活體或能夠快速冷凍；另外，對(duì)一些稀有物種和瀕危種，鮮活樣品的采集十分困難，一般為了解決這些問題，常采用乙醇和甲醛固定的方法來處理樣品，再對(duì)樣品DNA 進(jìn)行提取以及擴(kuò)增。使用乙醇固定樣品具有硬化，固定，脫水作用，對(duì)組織滲透迅速，特別適合組織中核酸的保存，相比于甲醛等其它固定方法，此法更簡(jiǎn)單，保存時(shí)間更長(zhǎng)質(zhì)量更好，也更加清潔無害。乙醇固定樣品主要應(yīng)用于水產(chǎn)種質(zhì)資源鑒定，醫(yī)院或獸醫(yī)病理樣品保存，法醫(yī)樣品保存等方面，在特定物種基因保護(hù)，生物多樣性，動(dòng)物分子標(biāo)記，司法鑒定等方面有廣泛的應(yīng)用。
Omega Bio-Tek 相應(yīng)試劑盒既能夠快速有效的抽提得到乙醇保存多年的樣品基因組DNA，又可以利用直接PCR 系統(tǒng)，快速的對(duì)乙醇保存樣品進(jìn)行PCR 鑒定，為您的研究提供最有力的工具。
實(shí)驗(yàn)材料
乙醇浸泡的魚苗
實(shí)驗(yàn)步驟
1. E.Z.N.A. Tissue Direct PCR kit
1) 分別取45ul AT1 和5ul AT2 到0.2ml PCR 管中，混合均勻。對(duì)于有較多樣品需要操作的，可以先將AT1 和AT2 用量計(jì)算好，混合均勻后再分裝到每一管中。
2) 取魚苗一條，在AT4 中浸泡約5-10min，濾紙吸干水份。
3) 將魚苗浸沒在上一步準(zhǔn)備的AT1 中56℃水浴或者PCR 儀上消化10-20min，中間可以渦旋混勻一次。
4) 消化完后的PCR 管置于90℃水浴或者PCR 儀上5min，稍微冷卻后加入50ul AT3 渦旋混勻。
5) 以上裂解液就可以作為PCR 的模板直接使用，PCR 體系中建議加入5ul 左右。
6) 取5ul E.Z.N.A. Tissue Direct PCR kit 抽提得到的一條魚苗的DNA 作為模板，客戶提供的引物Y-30-R/F 作為引物，PCR 擴(kuò)增。
7) PCR 擴(kuò)增程序：
94℃ 2min；
94℃ 30S 52℃ 30S 72℃ 40S 33cycles；
72℃ 5min；
25℃ forever。
2. E.Z.N.A.? MicroElute? Genomic DNA Kit
1) 稱量10mg 組織，加入200ul Buffer TL；
2) 加20ul OB，55℃孵化至wan全降解；
3) 13,000xg 離心2min，轉(zhuǎn)移上清至新管；
4) 加220ul Buffer BL 渦旋混勻，70℃孵化10min；
5) 加220ul 無水乙醇，最大速度渦旋15s；
6) 將混合液過柱吸附，13,000xg 離心30-60s，棄濾液；
7) 加500ul Buffer HB，離心；
8) 700ul DNAWash Buffer（加乙醇）；
9) 13,000xg 離心2min，干燥柱子；
10) 加25ul 70℃預(yù)熱的Elution Buffer 洗脫。
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