革蘭氏染色是大家檢測過程中常用到的基本技能之一，也是輔助我們鑒別菌種種類的基礎(chǔ)方法之一。但大家在日常的革蘭氏染色過程中有沒有發(fā)現(xiàn)過這樣的問題：明明是革蘭氏陰性菌，怎么我的染色結(jié)果是陽性呢？或者怎么陽性菌被我染成陰性了呢？為什么會產(chǎn)生這樣的偏差？

革蘭氏染色是一項經(jīng)典的細(xì)菌鑒別手段，自19世紀(jì)80年代丹麥的醫(yī)師GRAM創(chuàng)立起，至今已經(jīng)近一個半世紀(jì)，仍舊在細(xì)菌的檢測和鑒定分類上被廣泛應(yīng)用著。在我國，GB 4789系列的國標(biāo)中很多致病菌的檢測也都需要進(jìn)行革蘭氏染色，可見其重要性。甚至可以說沒有精準(zhǔn)掌握革蘭氏染色的微生物檢驗員，不會是一個合格的檢驗員。

革蘭氏染色的原理：

細(xì)菌細(xì)胞通過結(jié)晶紫初染和碘液媒染后，在細(xì)胞壁內(nèi)形成了不溶于水的結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物，革蘭氏陽性菌由于其細(xì)胞壁較厚、肽聚糖網(wǎng)層次較多且交聯(lián)致密，故遇乙醇或丙酮脫色處理時，因失水反而使網(wǎng)孔縮小，再加上它不含類脂，故乙醇處理不會出現(xiàn)縫隙，因此能把結(jié)晶紫與碘復(fù)合物牢牢留在壁內(nèi)，使其仍呈紫色；而革蘭氏陰性菌因其細(xì)胞壁薄、外膜層類脂含量高、肽聚糖層薄且交聯(lián)度差，在遇脫色劑后，以類脂為主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖網(wǎng)不能阻擋結(jié)晶紫與碘復(fù)合物的溶出，因此通過乙醇脫色后仍呈無色，再經(jīng)沙黃等紅色染料復(fù)染，就使革蘭氏陰性菌呈紅色。

革蘭氏染色的步驟：

涂片、晾干、固定、染色、水洗、媒染、脫色、復(fù)染。此處不加贅述。

影響革蘭氏染色結(jié)果準(zhǔn)確性的關(guān)鍵因素：

1.試劑影響。這是我們首先應(yīng)該確保的，我們使用的試劑必須是有效的。實驗室應(yīng)當(dāng)建立有效的試劑管理程序，從試劑的驗收到存放、使用、過期后的廢棄處理都應(yīng)有嚴(yán)格規(guī)定，確保我們使用的試劑是有效的。工欲善其事必先利其器，這也是我們試驗成功最基礎(chǔ)的一環(huán)。

2.染色菌的選擇。菌齡對革蘭氏染色結(jié)果的影響是十分大的。我們?nèi)旧^程中選擇的菌應(yīng)該是處于活躍生長期，這樣的細(xì)菌活性強，生理特征明顯，所以染色的結(jié)果準(zhǔn)確度高，一般情況下不會出現(xiàn)誤差。培養(yǎng)時間較長的革蘭氏陽性菌，由于細(xì)胞老化，甚至有部分菌在染色之前就已經(jīng)死亡或者自行溶解了，造成細(xì)胞壁通透性增加，就會呈現(xiàn)出假陰性。以金黃se葡萄球菌為例，金葡是典型的革蘭氏陽性菌，有人曾經(jīng)統(tǒng)計過培養(yǎng)至不同時間的金葡的革蘭氏染色結(jié)果，結(jié)果表明，在金葡活躍期的22h-26h之間，染色結(jié)果的準(zhǔn)確率基本可以達(dá)到100%，而超過26h之后，準(zhǔn)確率就開始下降，培養(yǎng)至36h時，準(zhǔn)確率大概會下降30%左右。所以我們在染色時，一定要選擇處于活躍期、活性較強的菌落，在檢測過程中一定要嚴(yán)格的在國標(biāo)要求的時間段內(nèi)進(jìn)行染色試驗，不能提前或者延后。

3.涂菌的狀態(tài)。在染色最初的涂布中，在挑取菌體后應(yīng)該在無菌水上涂成薄薄的菌膜。而在涂布過程中，若是菌體堆積，也會極大影響染色結(jié)果的準(zhǔn)確性。菌落堆積過多，往往菌體之間變得毫無縫隙，而其細(xì)胞壁的成分影響造成了脫色的情況不佳，容易產(chǎn)生假陽性的結(jié)果。同時，在初染、媒染及復(fù)染的過程中，應(yīng)將染液覆蓋整個菌膜，避免一部分菌染色而另一部分菌沒有染色。因此在涂片過程一定要將菌膜涂得少而均勻，這樣才能達(dá)到最佳效果。

4.媒染時間。媒染時間對革蘭氏陰性菌的染色結(jié)果有很大影響。由于媒染時間過長，結(jié)晶紫在碘液長時間作用下過分牢固結(jié)合在菌體細(xì)胞壁上，影響了酒精的脫色效果，從而會導(dǎo)致這種假陽性的效果。以典型的革蘭氏陰性菌大腸埃希氏菌為例，有人做過統(tǒng)計，媒染時間嚴(yán)格控制在40s-60s之內(nèi)，染色結(jié)果準(zhǔn)確率基本可達(dá)到100%，而超過60s準(zhǔn)確率會有一定的降低，若媒染超過100s，準(zhǔn)確率甚至可降低接近20%左右。因此在媒染過程中一定要注意媒染時間，控制在50-60s為宜。

5.酒精脫色。酒精脫色也是一個對結(jié)果影響較大的操作過程。革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌最主要的差異是細(xì)胞壁肽聚糖層厚度和結(jié)構(gòu)，革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁肽聚糖層很薄，脂多糖含量高因此在酒精脫色時，細(xì)菌細(xì)胞壁的多糖成分會被酒精溶解，增大了細(xì)胞壁的通透性，結(jié)晶紫及碘復(fù)合物就很快被酒精洗脫，之后就會被沙黃復(fù)染呈紅色；而陽性菌肽聚糖層厚，脂多糖少，酒精只能起到脫水效果而無法進(jìn)入，這樣結(jié)晶紫和復(fù)合物就無法洗脫出來使細(xì)胞呈紫色。因此，酒精脫色時間短，脫色效果不佳，會導(dǎo)致陰性菌菌體內(nèi)的結(jié)晶紫和復(fù)合物不能有效的全部洗脫出來，就會出現(xiàn)明顯的誤差，使陰性菌出現(xiàn)假陽性。而洗脫時間過長，也會導(dǎo)致陽性菌的細(xì)胞壁被酒精破壞，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的紫色被洗脫，呈現(xiàn)假陰性。因此洗脫時間也是革蘭氏染色的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。洗脫時間應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格控制在20s-30s之間，同時保證洗脫效果。

總結(jié)一下，在整個革蘭氏染色過程中，在保證試劑有效的前提下，需要嚴(yán)格控制的幾個方面：染色菌必須是在其活躍期內(nèi)，涂布狀態(tài)不可太厚，媒染時間嚴(yán)格控制在50s-60s之間，脫色時間嚴(yán)格控制在20s-30s。把握以上的關(guān)鍵控制點，革蘭氏染色基本就不會出現(xiàn)問題啦！