標(biāo)準(zhǔn)品是標(biāo)記免疫分析定量的依據(jù)。標(biāo)準(zhǔn)品的正確與否直接影響樣品的測(cè)定結(jié)果。如果在連續(xù)測(cè)定中，或各實(shí)驗(yàn)室之間使用的標(biāo)準(zhǔn)品不一致，則可影響到實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可比性。為此，對(duì)標(biāo)記免疫分析所使用的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)滿足如下要求。
一、標(biāo)準(zhǔn)品的要求
1、化學(xué)結(jié)構(gòu)：原則上標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)與被測(cè)物具有完/全相同的化學(xué)結(jié)構(gòu)，包括相同的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)。但在實(shí)際工作中，用化學(xué)結(jié)構(gòu)完//全相同的物質(zhì)作標(biāo)準(zhǔn)品是十分困難的。這是由于一方面來源有限，另一方面有些被測(cè)物本身的化學(xué)結(jié)構(gòu)還不清楚，或是有明顯的異型性。所以有時(shí)也用結(jié)構(gòu)類似的物質(zhì)作標(biāo)準(zhǔn)品。此時(shí)，應(yīng)充分了解這些物質(zhì)與真正標(biāo)準(zhǔn)品之間的定量關(guān)系。
2、化學(xué)純度：所有通過化學(xué)合成法制備的小分子化合物，都應(yīng)是高化學(xué)純度的純品。對(duì)某些蛋白類物質(zhì)，則可能由于純化的方法不同而有差異。對(duì)此，在最初建立該方法時(shí)，應(yīng)與國/際上*的標(biāo)準(zhǔn)參考品或高純度的純品進(jìn)行比對(duì)。
3、免疫純度：標(biāo)記免疫分析是通過比較被測(cè)物質(zhì)與標(biāo)準(zhǔn)品的免疫活性實(shí)現(xiàn)的，故被測(cè)物質(zhì)與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)所用抗體的免疫活性應(yīng)該完/全一致，即兩者對(duì)所用的同一抗體有完/全相同的親和力。因此，標(biāo)準(zhǔn)品的免疫純度比其化學(xué)純度更重要。
4、反應(yīng)介質(zhì)：免疫學(xué)反應(yīng)受反應(yīng)介質(zhì)和溫度等條件的影響，所以理論上要求標(biāo)準(zhǔn)品和被測(cè)物應(yīng)在完/全相同的介質(zhì)中進(jìn)行反應(yīng)。如測(cè)定血清中某物質(zhì)的濃度，其所用的標(biāo)準(zhǔn)品也應(yīng)溶解在無被測(cè)物的零值血清中；如測(cè)定尿液中某物質(zhì)的濃度，其所用的標(biāo)準(zhǔn)品也應(yīng)溶解在無被測(cè)物的尿液中等。但在實(shí)際工作中這一點(diǎn)很難做到。因?yàn)?，血清中的成分十分?fù)雜，因而無被測(cè)物的零值血清的制備非常困難，而且個(gè)體血清中還可能存在一些干擾物質(zhì)。理想的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)該用與被測(cè)樣品相同的基質(zhì)(如血清)，先將被測(cè)物質(zhì)完/全去除，然后再加入已知量的被測(cè)物質(zhì)的純品。
5、干擾物質(zhì)：標(biāo)準(zhǔn)品中不能有干擾分析的物質(zhì)。在作為標(biāo)準(zhǔn)品使用前，必須對(duì)那些從機(jī)體提取到的大分子物質(zhì)活性進(jìn)行測(cè)定。
6、標(biāo)準(zhǔn)品的批量：為保證檢測(cè)的連續(xù)可比性，每批標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)有相當(dāng)大的量，以保證在較長的時(shí)間內(nèi)使用。每批標(biāo)準(zhǔn)品如保存的條件適當(dāng)，在相當(dāng)長的時(shí)間內(nèi)可保持其濃度和免疫活性的穩(wěn)定。這對(duì)于生產(chǎn)標(biāo)記免疫分析試劑的廠家尤為重要。
二、標(biāo)準(zhǔn)品的分級(jí)
所謂標(biāo)準(zhǔn)品在英語中有三個(gè)名詞，即標(biāo)準(zhǔn)品 (standard)、校準(zhǔn)品(calibrator)和參考品(reference)。這三個(gè)名詞的意義不完/全相同，但在國內(nèi)它們則經(jīng)常被混淆。目前在我國的標(biāo)記免疫分析實(shí)踐中，所謂的"標(biāo)準(zhǔn)品"實(shí)際上是指校準(zhǔn)品。為使用方便先仍用"標(biāo)準(zhǔn)品一詞"。
有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)品可分為如下的等級(jí)：
【國際參考品(international reference)】：國際參考品是由WHO指/定的實(shí)驗(yàn)室制備，并與有關(guān)國家的一定機(jī)構(gòu)聯(lián)系(在我國是衛(wèi)生部藥品與生物制品檢定所)，被國/際*為最/高級(jí)別的標(biāo)準(zhǔn)品。到目前為止，與標(biāo)記免疫分析有關(guān)的已達(dá)數(shù)十種。但由于標(biāo)記免疫分析方法的迅速發(fā)展，很多標(biāo)記免疫分析方法還沒有國際參考品。
【國/家級(jí)標(biāo)準(zhǔn)品】：國/家級(jí)標(biāo)準(zhǔn)品是由國家的有關(guān)權(quán)/威機(jī)構(gòu)，用高化學(xué)純和高免疫純、低交叉反應(yīng)的純品制備的，供國家內(nèi)部使用。國/家級(jí)標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)與國際參考品或其他國家的國/家級(jí)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比對(duì)。我國現(xiàn)已有國/家級(jí)標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)種，如胰島素(insulin)、絨毛膜促性腺素(hCG)、三碘甲狀腺原氨酸(T3)、甲狀腺素(T4)、肝膽酸(CG)、甲胎蛋白(AFP) 等。
【實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)】：實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)是由實(shí)驗(yàn)室自己，或由生產(chǎn)廠家制備的標(biāo)準(zhǔn)品，又稱二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)品。所有的二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)品都必須經(jīng)過與國家標(biāo)準(zhǔn)品或國際參考品進(jìn)行比對(duì)或校正。如沒有國際參考品或國/家級(jí)標(biāo)準(zhǔn)品的，也應(yīng)與國/際*的生產(chǎn)廠家的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比對(duì)。
三、標(biāo)準(zhǔn)品的制備、鑒定、與計(jì)量
1、標(biāo)準(zhǔn)品的制備：標(biāo)準(zhǔn)品的制備是非常復(fù)雜的問題，也是標(biāo)記免疫分析中比較難于制備的一個(gè)成分。以下討論的是實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)品(或商品化試劑中標(biāo)準(zhǔn)品)的制備。
?。?）基質(zhì)的制備：如前所述，作為標(biāo)準(zhǔn)品的介質(zhì)(基質(zhì))成分應(yīng)與被測(cè)樣品相同。對(duì)大多數(shù)用于測(cè)定血清中某物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)用不含被測(cè)物質(zhì)的零血清制備，以求反應(yīng)的介質(zhì)環(huán)境相當(dāng)。但有時(shí)零值血清的制備十分困難，所以有些標(biāo)準(zhǔn)品用適當(dāng)?shù)木彌_液制備，并在緩沖液中加入一定量的載體蛋白(一般用1%～2%的牛血清白蛋白)，以便使其與樣品的介質(zhì)環(huán)境相近。
零值血清的制備方法有：
A、吸附法：血清中小分子物質(zhì)如三碘甲狀腺原氨酸 (T3)、甲狀腺素(T4)等，可用活性炭吸附去除。這種方法簡便，但待測(cè)物質(zhì)難以清除干凈，而且大分子活性物質(zhì)不能用此法進(jìn)行制備。
B、反復(fù)凍融法：對(duì)大分子活性物質(zhì)可選用低值血清，經(jīng)反復(fù)凍融使被測(cè)物質(zhì)失活。用這種方法可使某些蛋白類激素大部分失活，但也難以得到真正的零值血清。
C、親和層析法：用特異性抗體制備親和層析柱，用以吸附被測(cè)抗原。用這種方法可以得到高質(zhì)量的零值血清，但本法比較復(fù)雜而且成本也高。
?。?）標(biāo)準(zhǔn)物純品的選擇：應(yīng)選擇高化學(xué)純和高免疫純的純品作標(biāo)準(zhǔn)品。其中免疫純尤為重要，在標(biāo)準(zhǔn)品中不應(yīng)含有與被測(cè)物質(zhì)有交叉反應(yīng)的物質(zhì)。
?。?）標(biāo)準(zhǔn)品的制備：先用零值血清配置高濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的要求，用零值血清將高值血清稀釋至應(yīng)有的濃度，制成符合預(yù)定要求的，由不同濃度組成的系列標(biāo)準(zhǔn)品。
2、標(biāo)準(zhǔn)品的鑒定
?。?）免疫活性的鑒定：選用高特異性的抗血清分別作*標(biāo)準(zhǔn)品(如WHO的國際參考品或國家標(biāo)準(zhǔn)品)的待鑒定標(biāo)準(zhǔn)品的劑量反應(yīng)曲線，并觀察兩條曲線的平行性。如兩條劑量反應(yīng)曲線平行，說明兩種物質(zhì)對(duì)同一抗體有相同的親和力，即二者是同質(zhì)性物質(zhì)。如兩條劑量反應(yīng)曲線不平行，說明兩種物質(zhì)具有異質(zhì)性，因而這一待鑒定的標(biāo)準(zhǔn)品是不能使用的。
?。?）濃度的標(biāo)定：用已鑒定過的，免疫活性合格的標(biāo)準(zhǔn)品，與*的標(biāo)準(zhǔn)品作濃度相同的劑量反應(yīng)曲線。此時(shí)，兩條劑量反應(yīng)曲線應(yīng)該是基本重合的。如果兩者平行但不重合，則取兩條劑量反應(yīng)曲線的50%結(jié)合處的相應(yīng)劑量( ED50 )計(jì)算二者的換算系數(shù)，然后調(diào)整待鑒定標(biāo)準(zhǔn)品的濃度，直至使兩條劑量反應(yīng)曲線完/全或基本重合為止。
3、標(biāo)準(zhǔn)品的計(jì)量：許多小分子抗原或半抗原已能得到純品或進(jìn)行合成，它們對(duì)作為標(biāo)準(zhǔn)品的要求可以得到基本的滿足，其計(jì)量多直接用單位體積中的重量表示，如mg / ml、ng / ml 、pg / ml等。最近WHO推薦用質(zhì)量單位取代重量單位，即mol / L、mmol / L、或nmol / L等。對(duì)大分子的活性物質(zhì)則比較復(fù)雜。由于得不到絕對(duì)的純品，故很難直接用單位體積中的重量或單位體積中的質(zhì)量計(jì)量。因此，常用該物質(zhì)的生物活性單位表示，如IU / L、mIU / L等。
四、標(biāo)準(zhǔn)品的穩(wěn)定性與保存
如前所述，為保證檢測(cè)的連續(xù)可比性，每批標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)有相當(dāng)大的量，以保證能在較長時(shí)間內(nèi)使用。因此，每批標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)在適當(dāng)?shù)臈l件下保存，使其免疫活性和濃度保持穩(wěn)定。
1、影響標(biāo)準(zhǔn)品穩(wěn)定的因素
?。?）基質(zhì)中的酶、細(xì)菌污染、pH的變化、氧化、潮濕等因素都可以導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)品的變性，而且這些變化可因高溫和光照加速。
?。?）在保存過程中發(fā)生聚合反應(yīng)等分子結(jié)構(gòu)的變化，可使標(biāo)準(zhǔn)品失活。
?。?）容器內(nèi)壁的吸附作用和溶劑的蒸發(fā)可造成標(biāo)準(zhǔn)品濃度的改變。
（4）保存條件不適當(dāng)也可以影響標(biāo)準(zhǔn)品的穩(wěn)定性，如反復(fù)的凍融可降低標(biāo)準(zhǔn)品的免疫活性等。
2、標(biāo)準(zhǔn)品的保存方法
（1）冷凍干燥法：冷凍干燥對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和免疫活性無明顯的影響，是目前最/常用的保存方法。冷凍干燥制品在低溫下，可在較長的時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定。但應(yīng)用冷凍干燥制品時(shí)，復(fù)溶體積的準(zhǔn)確度十分重要。因此，要用經(jīng)過校準(zhǔn)的量器準(zhǔn)確的復(fù)溶，以減少標(biāo)準(zhǔn)品的濃度誤差。
?。?）在標(biāo)準(zhǔn)品中加一定量的防腐劑可減少細(xì)菌污染的影響。
（3）密閉真空保存或充入惰性氣體等方法也可以增加標(biāo)準(zhǔn)品的穩(wěn)定性。 目前最/常用的方法是：在標(biāo)準(zhǔn)品中加入少量的防腐劑(如0.1%疊氮鈉或0.1%硫柳汞)，冷凍干燥后密封，并在低溫下保存。但應(yīng)注意，一旦復(fù)溶后應(yīng)放低溫保存，并不得反復(fù)凍溶。復(fù)溶后的標(biāo)準(zhǔn)品其有效期明顯縮短，一般不超過6～8周，有些物質(zhì)可能更短。
