RNA的提?。簻?zhǔn)備試劑：lu仿，yi丙醇，75℅乙醇，無RNase的水或0.5℅SDS(溶液均需用DEPC處理過的水配制)

　　操作步驟:

　　1. 勻漿處理:a.組織 將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

　　b.單層培養(yǎng)細(xì)胞 直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

　　c．細(xì)胞懸液 離心收集細(xì)胞，每5-10×106動物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。

　　2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物*分離。

　　3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

　　5. 每使用1ml TRIzol加入0.2mllu仿，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

　　6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol 試劑的60℅。

　　7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

　　8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

　　9. 用75℅乙醇洗滌RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇。2-8℃不超過7500×g離心5分鐘，棄上清。

　　10.室溫放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大約晾5-10分鐘即可.不要真空離心干燥，過于干燥會導(dǎo)致RNA的溶解性大大降低。加入25-200μl無RNase的水或0.5℅SDS,用槍頭吸打幾次,55-60℃放置10分鐘使RNA溶解.如RNA用于酶切反應(yīng),勿使用SDS溶液。RNA也可用100℅的去離子甲酰胺溶解，-70℃保存。

　　注意事項：

　　1.從少量樣品（1-10mg組織或102-104細(xì)胞）中提取RNA時可加入少許糖原以促進(jìn)RNA沉淀。例如加800ml TRIzol勻漿樣品，沉淀RNA前加5-10μg RNase-free糖原。糖原會與RNA一同沉淀出來，糖原濃度不高于4mg/ml是不影響第一鏈的合成，也不影響PCR反應(yīng)。

　　2．勻漿后加lu仿之前樣品可以在-60至-70℃保存至少一個月。RNA沉淀可以保存于75% 酒精中2-8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。

　　3．分層和 RNA沉淀時也可使用臺式離心機，2600×g離心30-60分鐘。

　　預(yù)期產(chǎn)量：1mg組織或1×106細(xì)胞提取RNA分別為：

　　肝和脾 6-10μg ,腎3-4μg ,骨骼肌和腦組織1-1.5μg ,胎盤1-4μg ,上皮細(xì)胞8-15μg ,成纖維細(xì)胞5-7μg 。

　　常見問題分析：

　　得率低：A.樣品裂解或勻漿處理不*

　　B．RNA沉淀未*溶解

　　A260/A280<1.65 ：A.檢測吸光度時，RNA樣品沒有溶于水，而溶于了TE中。低離子濃度和低pH值條件下A280值偏高

　　B．樣品勻漿時加的試劑量太少

　　C．勻漿樣品時未在室溫放置5分鐘

　　D．吸取水相時混入了有機相

　　E．RNA沉淀未*溶解。

　　RNA降解：A.組織取出后沒有馬上處理或冷凍

　　B.待提取RNA的樣品沒有保存于-60至-70℃,而保存在了-5至-20℃

　　C.細(xì)胞在用胰/酶處理時過度

　　D.溶液或離心管未經(jīng)RNase去除處理

　　E.電泳時使用的甲醛pH值低于了3.5

　　DNA污染: A. 樣品勻漿時加的試劑量太少

　　B.樣品中含有有機溶劑(如乙醇,DMSO等),強緩沖液或堿性溶液

　　蛋白聚糖和多糖污染: 沉淀RNA的過程中作以下改進(jìn)可去除這些污染，步驟7中,每使用1ml TRIzol在水相中加0.25ml異丙醇和0.25ml高鹽溶液(0.8M檸檬酸鈉和1.2M NaCl)混合離心,按之前操作進(jìn)行。這種方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中，高效沉淀出純RNA。從含有大量多糖的植物中提取RNA時應(yīng)在勻漿后離心，并加上以上操作步驟。