(一)原理

Western blot是一種在PVDF或硝酸纖維素（NC）膜上進行的抗原抗體反應(yīng)。蛋白電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移至膜上，再與特異性抗體孵育，洗去游離的抗體，然后和酶標(biāo)記的二抗孵育，再進行底物顯色。由于抗原抗體反應(yīng)特異性好，親合力高，Western blot檢測的靈敏度較高，尤其是采用酶促增強化學(xué)發(fā)光的方法（ECL）后，檢測的下限可達到pg水平。ECL是指酶催化底物發(fā)熒光，熒光可使X光片曝光。由于酶標(biāo)記在二抗上，二抗與一抗結(jié)合，而一抗特異性結(jié)合在目的蛋白條帶處，因此顯影、定影后觀察到的條帶即為目的蛋白帶。

（二）試劑和材料

1. PVDF膜或NC膜。

2.電泳緩沖液：25 mM Tris堿、250 mM甘氨/酸、0.1％SDS。

3.轉(zhuǎn)移緩沖液：實驗所用的PVDF或NC膜不同，轉(zhuǎn)移緩沖液也可能不同，因此請仔細參閱PVDF或NC膜說明書。

4.TBS（pH7.5）：6.05 g Tris堿（50mM）、8.76g NaCl（150mM）溶于800 ml雙蒸水,用 HCl調(diào) PH至7.5，補加水至1L。

5.TBST：TBS＋0.1％（v／v）Tween 20。

6.封閉液：1％試劑盒中的封閉液，或5％脫脂奶粉，溶于TBS中。

7.解離液：100 mM 二巰基乙醇、2％SDS。

8.化學(xué)發(fā)光Western blot試劑盒：生產(chǎn)這類試劑盒的公司包括 Roche、Pierce、Amersham 等，試劑盒中一般包括酶標(biāo)記二抗、發(fā)光波A和B。

（三）操作步驟

1. 灌制SDS－PAGE電泳膠，方法參見一般的分子生物學(xué)實驗方法。

2. 取免疫沉淀最后所得的上清,上樣，電泳。

3. 用電轉(zhuǎn)移裝置將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF或NC膜上。

4. 電轉(zhuǎn)移完畢后，取出膜,用TBS洗滌1次。

5. 將膜放入封閉液 于室溫封閉1 h, 或4℃封閉過夜。

6. 用封閉液稀釋識別目的蛋白的抗體至1－10 ug/ml，與含有目的蛋白條帶膜在室溫作用1 h。

7. TBST洗膜4次,每次15 min。

8. 按試劑盒說明書稀釋酶標(biāo)記二抗,與膜于室溫作用30min。

9. TBST洗膜4次，每次15 min。

10. 按試劑盒說明書混合發(fā)光液A和B，與膜作用1 min后進行X光片曝光。

11. X光片顯影和定影后觀察結(jié)果。

12. 如果結(jié)果不理想或要用相同的膜檢測另一種靶蛋白，可將膜與解離液于50℃作用30 min，去除結(jié)合于膜上的抗體, TBST洗2次，封閉后可重新檢測（即重復(fù) 6－11步）。

(四) 注意事項

1.用于 Western blot和免疫沉淀的抗體最好不同，否則將出現(xiàn)很多非特異性條帶。

2. Western blot中，轉(zhuǎn)移在膜上的蛋白處于變性狀態(tài)，其空間結(jié)構(gòu)被改變，因此那些識別空間表位的抗體不能用于Western blot檢測。這種情況下，可將表達目的蛋白的細胞或細胞裂解液中的所有蛋白先生/物素化，再用抗體進行免疫沉淀，得到的生/物素化的目的蛋白可用酶標(biāo)記親和素進行Western blot檢測。

3.化學(xué)發(fā)光法檢測的敏感度很高，實驗中取膠和膜必須帶一次性手套。

4. 曝光、顯影和定影需在暗室中進行，X光片用完后一定要收好，避免曝光。