材料與試劑：

PBS

乙醇，70-80%,提前放置-20°C預(yù)冷 固定劑

BD Pharmingen™stain buffer, or equivalent, 1X PBS, 2% FBS, 0.1% NaN3 (pH 7.1–7.4) 染色液

BD Pharmingen™PI/RNase staining buffer (for PI/Rnasestaining) PI/RNase染色液

BD Pharmingen™7-AAD (7-Amino-Actinomycin D) staining solution (for 7-AAD staining) 7-AAD染色液

使用說(shuō)明：

DNA染料，尤其是PI，具有較強(qiáng)的粘性。樣本上機(jī)檢測(cè)之后，應(yīng)遵照儀器說(shuō)明書(shū)仔細(xì)清洗流式細(xì)胞儀，以免對(duì)下一位操作者結(jié)果造成影響 。固定好的細(xì)胞可保存長(zhǎng)達(dá)12個(gè)月 (儲(chǔ)存于70-80% 的乙醇，置于 -20°C保存).

操作步驟：

1. 收獲細(xì)胞于流式管中，加入3-4ml的PBS清洗細(xì)胞。

2. 1000rpm離心10分鐘，棄上清。

3. 逐滴加入5ml或更多預(yù)冷的70-80%的乙醇，渦旋混勻細(xì)胞， 4°C避光過(guò)夜（>18小時(shí)）。

4. 1000-1500rpm 離心細(xì)胞10分鐘，棄上清。之后清洗細(xì)胞2次以去除所有的乙醇。

注：第一次用1x PBS，第二次用染色液

5. 細(xì)胞染色：每管樣本需10^6細(xì)胞。具體操作如下：

1) 對(duì)于PI/RNase 染色，將細(xì)胞重懸于0.5 mL PI/RNase 染色液.

2) 對(duì)于7-AAD染色，將細(xì)胞重懸于0.1 mL 染色液,同時(shí)加入20 μL7-AAD染色液.

6. 室溫避光孵育15分鐘。

7. 分析前4℃避光保存樣本。1小時(shí)之內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。 

樣本制備注意事項(xiàng)：

1.獲得單個(gè)細(xì)胞，盡量避免DNA的降解

2.樣本最關(guān)鍵的就是減少碎片（EDTA/不可過(guò)度吹打/離心rpm）

3.PI既能與DNA結(jié)合，又能與RNA結(jié)合，所以要用RNase降解

4.PI質(zhì)量及RNase所加量很重要，建議用商品化試劑

5.污染脫氧核糖核酸酶會(huì)降解DNA，故玻璃器皿和試劑要干凈滅菌

樣本檢測(cè)注意事項(xiàng)：

1.進(jìn)樣速度：一般檢測(cè)細(xì)胞濃度調(diào)整為2E5–2E6/ml，進(jìn)樣速度為低速。若峰形較寬，可能就是進(jìn)樣速度太快

2.儀器質(zhì)控定期做，盡可能排除因機(jī)器設(shè)置引起的峰形加寬

3.排除粘連細(xì)胞（FL2-A/FL2-W）

4.通過(guò)電壓脈沖信號(hào)的寬度和面積區(qū)別實(shí)體組織標(biāo)本中的粘連細(xì)胞群體，最大/程度的減少粘連細(xì)胞帶來(lái)的假陽(yáng)性結(jié)果