很多小伙伴在對膠片印跡進行短暫曝光后，檢測不到目的蛋白。可從以下幾個方面來優(yōu)化實驗步驟：

1、裂解物制備
每道全細胞提取物的 20–30 ?g 總蛋白，通常足夠用來檢測。如果靶標蛋白的基礎水平，或蛋白質(zhì)修飾程度低，可能需要通過化學刺激劑來誘導表達或修飾。你可能要調(diào)查備選細胞系或組織，其所含的目的蛋白含量更高。應將樣品溶解于適當?shù)木彌_液中，該緩沖液包含蛋白酶抑制劑和針對磷酸化目標的磷酸酶抑制劑。應務必對裂解物進行超聲處理，以確保有效的染色質(zhì)和膜結(jié)合靶標的蛋白質(zhì)提取。請查看我們網(wǎng)站上的對照物表，獲得推薦的陽性對照物和處理方法。

2、一抗稀釋和/或孵育
使用推薦的封閉劑（5% BSA 或 5% 脫脂奶粉），以推薦的稀釋度溶解于 TBST 中，在 4°C 下，過夜孵育一抗。使用備選封閉劑，如明膠、血清、無蛋白封閉劑、酪蛋白、或混合封閉劑，可能降低靶標信號強度。如需單個抗體的優(yōu)化結(jié)果，請查詢產(chǎn)品數(shù)據(jù)表找到推薦的稀釋緩沖液。

3、SDS-PAGE 凝膠選擇
一般來說，推薦采用 Tris-Glycine 凝膠。但是，對于高分子量蛋白質(zhì)，我們推薦采用 Tris-Acetate 凝膠和相關(guān)緩沖液。蛋白質(zhì)從 1 毫米凝膠轉(zhuǎn)移比從 1.5 毫米凝膠轉(zhuǎn)移更有效。使用更厚的凝膠，可能會導致高分子量蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移不*，所以我們推薦監(jiān)測轉(zhuǎn)移效率，根據(jù)目的靶標蛋白質(zhì)分子量大小，優(yōu)化轉(zhuǎn)移條件。

4、轉(zhuǎn)移和膜
可通過延長轉(zhuǎn)移時間或使用更高的電壓，可改善轉(zhuǎn)膜不*。一般來說，我們建議在轉(zhuǎn)移緩沖液中加入 20% 甲醇，然后在 70 V 電壓下進行為時 2 小時的濕轉(zhuǎn)。對于高分子量蛋白質(zhì)，我們建議減少轉(zhuǎn)移緩沖液中的甲醇至 5%，以提高轉(zhuǎn)移效率并避免大分子蛋白質(zhì)在凝膠基質(zhì)中固定，并且在 70 V 電壓下延長轉(zhuǎn)移時間至 3 小時。檢測較小的蛋白質(zhì)時，可能在轉(zhuǎn)膜期間出現(xiàn)過度轉(zhuǎn)移（過膜蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移）問題。對于小蛋白質(zhì)分子，使用孔隙大小為 0.2 ?m 的膜并在 70 V 電壓下進行為時 1.5 小時的濕轉(zhuǎn)，而不是使用孔隙大小為 0.45 ?m 的膜或進行過夜轉(zhuǎn)移，這樣做很重要，因為后者可能會導致過度轉(zhuǎn)移和丟失小蛋白質(zhì)分子信號。

5、封閉
膜封閉時間過長可能會掩蓋抗原表位，并阻止抗體結(jié)合。在室溫下僅封閉 1 小時。

6、洗滌
洗滌時間超過推薦的三次 5 分鐘是一個常見問題，可能會導致減少信號。我們推薦計時洗滌，以確保準確性。TBST 應包含 0.1% Tween? 20。這適用于一抗和二抗孵育后的洗滌步驟。此外，我們建議在 TBST 中洗滌，因為已有數(shù)據(jù)顯示在 PBST 中洗滌會導致減少信號。

7、二抗稀釋和/或孵育
可用相同的細胞提取物和一抗在印跡上進行二抗的梯度稀釋，以優(yōu)化二抗?jié)舛?。務必在室溫下，在?5% 脫脂奶粉的 TBST 中孵育二抗 1 小時。避免在 HRP-偶聯(lián)二抗的緩沖液中加入疊氮hua鈉，因為疊氮化物會抑制 HRP 的活性。

8、檢測試劑
采用能用抗-生/物素-HRP 進行檢測的生物/素化分子量標準作為化學發(fā)光檢測的陽性對照物。