微生物細胞的固定方法有主要有物理吸附法和包埋法兩種.
1．物理吸附法
帶電的微生物細胞和載體之間的靜電相互作用,使細胞體吸附固定在硅藻土、木材、玻璃、陶瓷和塑料等載體上.如酵母細胞是帶負電的,在固定時要選擇帶正電的載體.在PH4時,熱帶假絲酵母、釀酒酵母等在陶瓷表面上的吸附程度較大,載體表面的40~70%被細胞牢固吸附,不會被高流培養(yǎng)液沖掉.載體的性質也影響細胞與載體之間的相互作用,主要是載體的成分、表面電荷、表面積和PH的影響.所有的玻璃和陶瓷都是由不同比例的氧化硅、氧化鎂等組成,如將玻璃等放在溶液中,在它的表面會發(fā)生離子交換,形成不再是鋁、硅等的氧化物,而為相應的氫氧化物.載體表面的羥基可被微生物細胞表面的氨基或羧基所取代,在細胞與載體之間形成鍵.物理吸附法固定化活細胞的酶活性不受影響,但吸附過程相當復雜,吸附過程與微生物的性質、載體的特性及細胞與載體之間發(fā)生的相互作用有關,只有這些參數配合恰當時才能形成穩(wěn)定的微生物細胞-載體復合物.
2．包埋法
將微生物細胞用物理的方法包埋在瓊脂、海藻酸鈉、明膠、聚丙烯酰胺和聚yi烯醇（PVA）等凝膠載體內,使微生物細胞固定化.一般的包埋成形法比較復雜、機械性能差、易磨損、不適于大批量生產.因而近年來一些學者又研究了一種制備珠型固定化細胞技術.
1）瓊脂凝膠包埋法,稱取4g瓊脂或瓊脂糖溶于50ml 0.2M pH7.0磷酸緩沖液中,加熱溶解后,冷卻到55℃左右,將細胞濃度為60%左右細菌懸浮液于40℃下保溫,然后與瓊脂溶液混合均勻.用注射器針頭將熱的混合液滴入冷的甲苯溶液,四氯乙烯溶液或液體石臘內,冷卻形成2~3mm直徑的小球.或將熱瓊脂-細菌混合液流加到攪拌下的500ml30℃的醋酸丁酯中,加完后繼續(xù)攪拌3分鐘,到混合物分散成小滴,迅速加入300ml冷的醋酸丁酯,再攪拌2~5分鐘,傾去醋酸丁酯,抽濾干,用緩沖液洗至無醋丁酯味,即制成珠型固定化細胞,小珠約在1~3mm.使用前將球形固定化細胞放入消毒好營養(yǎng)液中30℃活化24小時后再用.
2）海藻酸鈣凝膠包埋法 稱取2g海藻酸鈉,加30ml生理鹽水于高壓滅菌鍋中加熱溶解、冷卻到40℃,取20ml與20ml細胞濃度為50%的細菌懸浮混合均勻,然后用注射器針頭滴加到0.1M氯化鈣或4%的氯化鋇溶液中,邊滴邊搖,使其形成2mm直徑球型小珠,然后用生理鹽水洗滌.或將混合液流加到攪拌下的200~500ml醋酸丁酯中,當分散成小滴后,迅速加入5ml 0.1M的二氯化鈣溶液,繼續(xù)攪拌5~10分鐘,自然沉降,傾去醋酸丁脂,再加入50ml 0.1M的二氯化鈣溶液,浸泡1小時,進一步固化,然后用蒸餾水*洗滌,即得直徑為1~3mm珠型固定化細胞.干后可保存于低溫下,使用前需放入消毒好的營養(yǎng)液中30℃活化24小時后再用.由于磷酸鹽會破壞凝膠的結構,因而在使用海藻酸鈉固定細胞時盡量防止磷酸鹽的加入.
3）明膠包埋法 稱取6g明膠,加入50ml 0.1M pH7.0的磷酸緩沖液,加熱溶解后冷卻至40℃,取20ml與20ml細胞濃度為60%的細菌懸液在40℃混合均勻,冷卻凝固后切成1~2mm3方塊,然后再加2.5%戊二醛,使包埋塊懸浮在戊二醛溶液中,室溫下輕輕攪拌4小時進行交聯,濾去戊醛后,逐次用0.1M氯化鈉和去離子水洗滌后即成.或者將明膠-菌體混合液流加到200ml 20℃攪拌下的醋酸丁酯溶液中,當分散成小珠后,迅速加入5ml 5%的戊二醛溶液,繼續(xù)攪拌5~10分鐘,傾去醋酸丁酯,水洗即得到珠型固定化細胞,再放入50ml的pH5.0的戊二醛溶液中浸泡30分鐘,然后*洗滌,即獲得直徑1~3mm的球形小珠.使用前將其放入營養(yǎng)液中30℃活化24小時后再用.用戊二醛交聯的明膠包埋法,可獲得機械強度及工作穩(wěn)定性較好的固定化細胞.
4）聚丙烯酰胺凝膠包埋法,引此法是較常用的一種包埋法.聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體和交聯劑甲叉雙丙烯酰胺在催化劑作用下聚合形成三維網狀結構的凝膠.常用的催化劑和加速劑是過硫酸銨和四甲乙二胺或三乙醇胺.
稱取17.6g丙烯酰胺和1.2g N—N′—甲叉雙丙烯酰胺溶于0.05M pH7.0的Tris-HCl緩沖液中,取20ml與5g的濕菌泥混合均勻,加入50μl的40%過硫酸銨,混合均勻后流加到攪拌的豆油或液體石蠟中,攪拌分散成小滴,迅速加入250μl的四甲基乙二胺,小滴即很快聚合形成小珠,傾去流體,用水或緩沖液充分洗滌即可獲得珠型固定化細胞.或將菌泥混合液加入1%過硫酸銨0.25ml和10%三乙醇胺4 ml,將上述混合液攪拌均勻,不要出現氣泡,置于40℃恒溫浴中30分鐘左右,即形成聚內烯酰胺凝膠固定化細胞,在凝膠未干時切成2~3mm3小塊,于50~60℃中干燥后保存.使用前將包埋好的固定化細胞放入消毒后的營養(yǎng)液中活化24小時再用.最chang用的是包埋法.
