RNAse的無處不在導(dǎo)致了RNA的脆弱敏感。要改善RNA提取的質(zhì)量，遠(yuǎn)慕生物為你介紹在RNA純化過程中要特別注意的10個問題。

在收獲組織及細(xì)胞死亡之后，應(yīng)立即滅活內(nèi)源的RNA酶，以防止RNA降解。

以下3個方法均可有效使內(nèi)源RNA酶失活：

1）用含離液（如胍鹽）的細(xì)胞裂解液收獲樣品，并立即勻漿。

2）用液氮瞬間凍結(jié)樣品。值得特別注意的是：組織塊必須保證足夠小，在浸入液氮的瞬間就能凍結(jié)，以確保瞬間令RNA酶失活

3）立即將樣品置于RNAlater? Tissue Collection: RNA Stabilization Solution中。它是一種水相、的收集試劑，能立即穩(wěn)定并保護(hù)完整、未凍結(jié)的組織和細(xì)胞樣品中的RNA。關(guān)鍵要點(diǎn)是組織樣品切片一定要夠?。?lt;0.5 cm），這樣RNAlater才能在RNase破壞RNA之前迅速滲入組織塊中。

使用正確的細(xì)胞或組織儲存條件

在樣品用液氮瞬間凍結(jié)之后，應(yīng)該儲存在-80°C，千萬不能解凍。即使是置于含有胍鹽的裂解液中作勻漿前的短暫解凍，也會導(dǎo)致RNA的降解和損失。瞬間凍結(jié)的組織應(yīng)該首先在超低溫條件下先研磨成粉，然后置于裂解液中進(jìn)行勻漿。

RNAlater使樣品儲存更為便利。儲存在RNAlater中的細(xì)胞或組織可在室溫下穩(wěn)定保存長達(dá)1個星期，在4°C可穩(wěn)定保存長達(dá)1個月，或永jiu保存在-20°C。

*勻漿樣品

細(xì)胞或組織的*勻漿對RNA提取來說，是一個很關(guān)鍵的步驟，它能夠防止RNA的損失和降解。勻漿的方法應(yīng)根據(jù)細(xì)胞或組織的類型來選擇。大部分培養(yǎng)的細(xì)胞可以置于細(xì)胞裂解液中，通過簡單的渦旋震蕩來勻漿；而動物組織、植物組織、酵母和細(xì)菌則常常需要更加劇烈的方法。比如說細(xì)菌的細(xì)胞壁，就需要酶消化來實(shí)現(xiàn)*的細(xì)胞裂解和RNA的zui大回收。有關(guān)各種不同的樣本類型，哪些方法是最shi合的勻漿方法，

在RNA提取之前預(yù)處理樣品裂解液

對于某些樣品來說，在勻漿之后，RNA提取之前，還需要一些額外的處理步驟。對于脂肪含量高的組織，像腦組織和脂肪組織得到的裂解液，就需要通過氯fang抽提來去除脂類，從而提高RNA產(chǎn)量。許多植物組織中富含多酚和多糖，會降低RNA的質(zhì)量和產(chǎn)量，用Plant RNA Isolation Aid 預(yù)處理裂解液可去除這些難以處理的成分。

選擇最hao的RNA分離方法

現(xiàn)有眾多的RNA分離方法也許令人難以取舍。目前zui簡單也是zui安全的方法是柱式分離，如RNAqueous? 或RNAqueous-4PCR Kit。因?yàn)椴僮骱唵?，所以這些步驟特別適用于同時處理多個樣品。如果是處理復(fù)雜的組織，如富含核酸酶（胰腺）或脂肪（腦和脂肪組織）的樣品，就推薦使用更加嚴(yán)格的、基于酚處理的RNA分離方法，如ToTALLY RNA?。

DNase處理

如果提取的RNA將用于RT-PCR，我們推薦用DNase處理純化的RNA樣品以去除殘留的DNA污染。當(dāng)樣品來源于富含DNA的組織，如脾臟時，DNase處理也是一個好辦法。Ambion的RNAqueous-4PCR Kit的實(shí)驗(yàn)流程中包含了DNase處理的步驟，并提供了必需的試劑（DNA酶I）。DNA-free? DNase treatment & Removal Reagents 則可用于去除用各種方法制備的RNA樣品中的DNA污染。這兩個產(chǎn)品都提供了高質(zhì)量的DNase I，優(yōu)化的反應(yīng)緩沖液，和DNA酶消化處理后簡單快速去除DNase的方法，無需使用有機(jī)溶劑和熱處理。

減少環(huán)境RNase的暴露

為了得到完整的、高品質(zhì)RNA，在整個RNA制備過程中，當(dāng)RNA離開強(qiáng)蛋白變性劑（如離液裂解液或酚）的保護(hù)時，避免引入新的RNase污染就非常關(guān)鍵。由于RNase幾乎是無所bu在，所以必須確保與純化的RNA接觸的每一樣?xùn)|西都是無RNase污染的。所有的表面，包括移液器、工作臺、玻璃器皿和制膠設(shè)備，都必須用表面去污凈化溶液如RNaseZap? 或RNaseZap Wipes 來處理過。必須保證一直使用無RNase的槍頭、試管和溶液，手套也應(yīng)經(jīng)常更換。

正確的沉淀

純化得到的RNA可能需要通過沉淀來濃縮，以滿足一些下游應(yīng)用的需要。醋酸銨(NH4OAc) 沉淀（加0.1體積的5 M 醋酸銨、2-2.5體積的無水乙醇，-20°C放置25分鐘以上）可以很好地回收RNA。如果需要定量回收低濃度的RNA（ng/ml），可以采用共沉淀（如糖原glycogen,、酵母yeast RNA或linear acrylamide）的方法。當(dāng)RNA用于RT-PCR分析時，線性的丙烯酰胺和DNase處理的糖原都可以作為理想的共沉淀劑，因?yàn)樗鼈兌疾缓珼NA污染。酵母RNA和未處理的糖原會給樣品帶來核酸污染，有可能影響RT-PCR的結(jié)果。沉淀后，注意避免RNA沉淀過分干燥，因?yàn)檫@可能導(dǎo)致很難重新溶解。

重懸

許多RNA提取步驟的zui后一步是溶解純化的RNA沉淀。理想的重懸溶液應(yīng)該滿足3點(diǎn)要求：無RNase污染、較低的pH值（pH 6-7）、含有螯合劑，以保護(hù)RNA不受帶入的RNase的降解。（THE RNA Storage Solution能滿足以上所有標(biāo)準(zhǔn)。）為了幫助溶解，RNA沉淀可置于重懸溶液中在65°C孵育5分鐘，并不時輕搖以幫助溶解。

儲存

如果只是短期儲存，重懸的RNA應(yīng)放置于-20°C；如果是長期儲存的話，就應(yīng)該放置于-80°C。盡管重懸于水或緩沖液中的RNA也可以儲存在-80°C，但保存于醋酸銨/乙醇溶液中的RNA沉淀則更加穩(wěn)定。我們推薦將RNA溶液分裝在幾支管中。這會避免反復(fù)凍融損傷RNA，并預(yù)防偶然的RNase污染。