在細(xì)胞相關(guān)的實(shí)驗(yàn)操作中，對于一些按常規(guī)方法難以轉(zhuǎn)染甚至無法轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，通過病毒介導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)?zāi)軌虼蟠筇岣呋虻霓D(zhuǎn)導(dǎo)效率，以達(dá)到目的基因的高效瞬時(shí)表達(dá)。

病毒轉(zhuǎn)染包括以下步驟：1構(gòu)建載體 2包裝提純病毒 3感染靶細(xì)胞。以慢病毒為例。

慢病毒（Lentivirus）載體是以HIV-1（人類免疫缺陷I型病毒）為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體。區(qū)別一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，它對分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力。慢病毒載體的研究發(fā)展得很快，研究的也非常深入。該載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達(dá)到持久性表達(dá)。在感染能力方面可有效地感染神經(jīng)元細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、干細(xì)胞等多種類型的細(xì)胞，從而達(dá)到良好的的基因治療效果，在美國已經(jīng)開展了臨床研究，效果非常理想，因此具有廣闊的應(yīng)用前景。

一、慢病毒載體構(gòu)建原理：

慢病毒載體的包裝系統(tǒng)一般由兩部分組成，即包裝成分和載體成分。包裝成分由HIV-1基因組去除了包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的順式作用序列而構(gòu)建，能夠反式提供產(chǎn)生病毒顆粒所必需的蛋白；載體成分則與包裝成分互補(bǔ)，即含有包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的順式作用序列，同時(shí)具有異源啟動子控制下的多克隆位點(diǎn)及在此位點(diǎn)插入的目的基因。將包裝成分與載體成分的多個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞，即可在細(xì)胞上清中收獲攜帶目的基因的復(fù)制缺陷型慢病毒載體顆粒。

慢病毒表達(dá)載體包含了包裝、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息。慢病毒包裝質(zhì)?？商峁┧械霓D(zhuǎn)錄并包裝RNA 到重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白。為產(chǎn)生高滴度的病毒顆粒，需要利用表達(dá)載體和包裝質(zhì)粒同時(shí)共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在細(xì)胞中進(jìn)行病毒的包裝，包裝好的假病毒顆粒分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中，離心取得上清液后，可以直接用于宿主細(xì)胞的感染，目的基因進(jìn)入到宿主細(xì)胞之后，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄，整合到基因組，從而高水平的表達(dá)效應(yīng)分子。

對于一些較難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，如原代細(xì)胞、干細(xì)胞、不分化的細(xì)胞等,能大大提高目的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，而且目的基因整合到宿主細(xì)胞基因組的幾率大大增加，這就為RNAi，cDNA 克隆以及報(bào)告基因的研究提供了一個(gè)有利的途徑。對進(jìn)行穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的篩選，為活體動物模型實(shí)驗(yàn)提供高質(zhì)量的包含目的基因的病毒液提供基礎(chǔ)。

二 、慢病毒載體構(gòu)建及包裝流程：

（一） 實(shí)驗(yàn)流程（1和2為并列步驟）

1.慢病毒過表達(dá)質(zhì)粒載體的構(gòu)建

設(shè)計(jì)上下游特異性擴(kuò)增引物，同時(shí)引入酶切位點(diǎn)，PCR(采用高保真KOD酶，3K內(nèi)突變率為0%)從模板中（CDNA質(zhì)?；蛘呶膸欤┱{(diào)取目的基因CDS區(qū)（coding sequence）連入T載體。將CDS區(qū)從T載體上切下，裝入慢病毒過表達(dá)質(zhì)粒載體。

2.慢病毒干擾質(zhì)粒載體的構(gòu)建

合成siRNA對應(yīng)的DNA頸環(huán)結(jié)構(gòu)，退火后連入慢病毒干擾質(zhì)粒載體

3. 慢病毒載體的包裝與濃縮純化

制備慢病毒穿梭質(zhì)粒及其輔助包裝原件載體質(zhì)粒，三種質(zhì)粒載體分別進(jìn)行高純度無內(nèi)毒素抽提，共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后6 h 更換為*培養(yǎng)基，培養(yǎng)24和48h后，分別收集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液，病毒上清液通過超離心濃縮病毒。

（二） 實(shí)驗(yàn)材料：慢病毒載體、包裝細(xì)胞和菌株

該病毒包裝系統(tǒng)為三質(zhì)粒系統(tǒng)，組成為pspax2, pMD2G, pLVX-IRES-ZsGreen1/pLVX-shRNA2。其中質(zhì)粒上的ZsGreen1表達(dá)框能表達(dá)綠色熒光蛋白（GFP）。

細(xì)胞株 293T，慢病毒的包裝細(xì)胞，為貼壁依賴型成上皮樣細(xì)胞，生長培養(yǎng)基為DMEM(含10% FBS)。貼壁細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)生長增殖形成單層細(xì)胞。

菌株大腸桿菌菌株DH5α。用于擴(kuò)增慢病毒載體和輔助包裝載體質(zhì)粒。

三、慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法

（一）慢病毒轉(zhuǎn)染貼壁細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法

1、 慢病毒轉(zhuǎn)染前18-24小時(shí)，將貼壁細(xì)胞以1×105/孔鋪到24孔板中。使細(xì)胞在慢病毒轉(zhuǎn)染時(shí)的數(shù)量為2×105/孔左右。

2、第二天，用含有6 μg/ml polybrene的2ml新鮮培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基，加入適量病毒懸液。37℃孵育。

3、(對polybrene毒性敏感的細(xì)胞選作此步驟)4小時(shí)后加入2ml新鮮培養(yǎng)基以稀釋polybrene。

4、繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，用新鮮培養(yǎng)基替換含有-bin毒的培養(yǎng)基。

5、繼續(xù)培養(yǎng)。如果慢病毒含有熒光蛋白，一般轉(zhuǎn)染48小時(shí)后可見明顯熒光表達(dá)，72小時(shí)后更加明顯。如需FACS檢測轉(zhuǎn)染效率，可在轉(zhuǎn)染后72-96小時(shí)進(jìn)行。如果慢病毒含有抗性基因并且需要加藥篩選，可以在轉(zhuǎn)染3-4天后開始加藥。

（二）慢病毒轉(zhuǎn)染懸浮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法

1、在2×105/ml懸浮細(xì)胞中加入polybrene至6 μg/ml和適量病毒，充分混勻。37℃孵育?；蛘?50g室溫離心4小時(shí)(選作，部分難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系采用此步驟可以提高轉(zhuǎn)染效率)。

2、(對polybrene毒性敏感的細(xì)胞選作此步驟)4小時(shí)后(或離心結(jié)束后)加入等體積新鮮培養(yǎng)基以稀釋polybrene。

3、繼續(xù)培養(yǎng)3-4天。中間視細(xì)胞生長情況可傳代或換液。

病毒感染細(xì)胞本來效率就較低，一定要注意以下幾點(diǎn)：1.感染時(shí)的培養(yǎng)基盡量少些；2. 每1ml的培養(yǎng)基中加入5-10ul的Polybrene（儲存液濃度為2mg/ml ），可以提高效率約3-5倍。不過病毒感染效率的問題都是相對的，達(dá)到自己的研究目的即可。