甘油保存菌種的基本要求

1.20%甘油保存菌種是指甘油:菌液=20:80,800ul菌液加200u滅菌l甘油后的甘油后,充分混勻后,-70度保藏.(注意甘油要慢慢吸)

2.將一般細菌的菌種純化后接種于普通肉湯管，4～6h增菌后，加入適量甘油一生理鹽水保存液，-20℃冰箱保存；鏈球菌屬和奈瑟氏菌屬的菌株純化后接種于血清肉湯管，在5％～10％CO2中經(jīng)8～10h增菌后，加入適量保存液，80℃低溫冰箱保存；真菌菌種純化后直接取菌洗入肉湯，不做培養(yǎng)，加入保存液后，-20℃冰箱保存。結(jié)果在連續(xù)3年實驗期內(nèi)，各菌種保存效果良好，且其形態(tài)結(jié)構(gòu)、染色特性、生化反應(yīng)等與標(biāo)準(zhǔn)株相符。結(jié)論使用甘油生理鹽水保存法來保存菌種，各菌種保存時間長，方法簡便，特別是使鏈球菌、奈瑟氏菌和弧菌等需特殊保存方法保存的菌株在一般實驗室得以保存。

3.常用的是終濃度10-30%的甘油。由于純甘油十分粘稠，很難定量，一般配成終濃度50%的水溶液，高壓滅菌后室溫保存即可。使用時按50%甘油:菌液=1:1混合均勻，然后迅速凍結(jié)。

A.先把甘油稀釋成50%，然后滅菌這樣20%的終濃度用400微的菌體加600微的50%甘油混合不就可以啦純的甘油太粘稠啦，用槍不好吸的

B終濃度15%。甘油配成80%的濃度，到時候加800微升菌體，200微升甘油就好。簡單的就在原來的培養(yǎng)基，如LB，或生理鹽水中加甘油，終濃度在20%左右，懸浮沉淀后裝小管扔冰箱凍起來就可以了。但時間不能太長，不要超過2~3個月，時間長了要重新活化、篩選。

甘油和水是互溶的，根本不是什么密封作用！甘油是為了防止冷凍結(jié)晶破壞細胞

甘油管保藏的菌種可以通過以下步驟復(fù)壯：

1. 將無菌操作臺滅菌30min后，用75％酒精棉球消毒包括手在內(nèi)的所有物品。

2. 使用滅菌接種環(huán)扣取甘油管中的冷凍菌塊，放入3mlLB液體培養(yǎng)基中。

3. 在37℃、150rpm的條件下過夜培養(yǎng)。

4. 將過夜菌液重新按照步驟2和步驟3活化一次，經(jīng)過2次活化的菌液即可用于實驗。

請注意，操作過程應(yīng)適當(dāng)快一些以減少凍存管內(nèi)的融化，并且應(yīng)提前準(zhǔn)備好所有物品，再從冰箱中取出保藏菌種。