實(shí)驗(yàn)原理
2-DE的第一向電泳等電聚焦是基于等電點(diǎn)不同而將蛋白粗步分離，第二向SDS-PAGE是基于蛋白質(zhì)分子量不同，而將一向分離后的蛋白進(jìn)一步分離。這樣就可以得到蛋白質(zhì)等電點(diǎn)和分子量的信息。
主要試劑
1. BSA
2. Bradford液
3. DTT
4. 0.05% 的溴酚蘭
5. IPG buffer (pH 3-10)
主要設(shè)備
1. 振蕩器
2. 高速離心機(jī)
3. 紫外分光光度計(jì)
4. 雙向電泳設(shè)備
實(shí)驗(yàn)材料
純化后的晶體蛋白
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 樣品的溶解
取純化后的晶體蛋白3.0mg，加入300ul裂解液(1mg蛋白:100ul裂解液)振蕩器上振蕩10min左右，共處理一個(gè)小時(shí)。其中每隔10～15分鐘振蕩一次，然后13200rpm離心15min除雜質(zhì)，取上清分裝，每管70ul，-80oC保存。
2. Bradford法測蛋白含量
取0.001g BSA（牛血清白蛋白）用1ml超純水溶解,測定BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品蛋白含量。
取7個(gè)10ml的離心管，首先在5個(gè)離心管中按次序加入0ul, 5ul, 10ul, 15ul, 20ul 的BSA溶解液，另2管中分別加入2 ul的待測樣品溶液，再在每管中加入相應(yīng)體積的雙蒸水（總體積為80ul），然后，各管中分別加入4ml的Bradford液（原來配好的Bradford液使用前需再取需要的劑量過濾一遍方能使用），搖勻，2min在595nm下，按由低到高的濃度順序測定各濃度BSA的OD值，再測樣品OD值。(測量過程要在一個(gè)小時(shí)內(nèi)完成)。例如：
編號 蛋白量（ul） Buffer(ul) Bradford(ml) OD595值
1 0 80 4 0
2 5 75 4 0.024
3 10 70 4 0.061
4 15 65 4 0.091
5 20 60 4 0.116
Bt4 2 78 4 0.079
Bt4 4 76 4
轉(zhuǎn)Bt4 2 78 4 0.075
轉(zhuǎn)Bt4 4 76 4
標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式：Y= aX b.其中Y為 OD值，X為蛋白含量。 a、b通過作圖輸入數(shù)據(jù)可知，相關(guān)系數(shù)通過輸入數(shù)據(jù)，作圖，軟件分析可得。
OD值測量過程：
比色皿用70%的乙醇保存，待用時(shí)用雙蒸水沖洗，再用無水乙醇沖洗，雙蒸水沖洗，再加入待測樣品溶液潤洗，然后，加入樣品，測定OD值。
3. 雙向電泳第一向---IEF（雙向電泳中一律使用超純水）
1) 水化液的制備
稱取2.0mg 的DTT，用700ul水化液儲液溶解后,加入8ul 0.05% 的溴酚蘭，3.5ul（0.5%v/v）IPG buffer (pH 3-10)振蕩混勻，13200rpm離心15min 除雜質(zhì)，取上清。在含300ug 蛋白（經(jīng)驗(yàn)值）的樣品溶解液中加入水化液，至終體積為340ul，振蕩器上振蕩混合,13200rpm離心15min除雜質(zhì)，取上清。
2) 點(diǎn)樣，上膠
分兩次吸取樣品，每次170ul, 按從正極到負(fù)極的順序加入點(diǎn)樣槽兩側(cè)，再用鑷子撥開Immobiline DryStrip gels (18cm，pH 3-10)膠條，從正極到負(fù)極將膠條壓入槽中,膠面接觸加入的樣品。注意：膠條使用前，要在室溫中平衡30分鐘；加樣時(shí)，正極要多加樣，以防氣泡的產(chǎn)生；壓膠時(shí)不能產(chǎn)生氣泡；酸性端對應(yīng)正極，堿性端對應(yīng)負(fù)極；樣品加好后，加同樣多的覆蓋油(Bio-Rad)，兩個(gè)上樣槽必須與底線齊平。
3) IPG聚焦系統(tǒng)跑膠程序的設(shè)定（跑膠溫度為20oC）
S1 (30v, 12hr, 360vhs, step)
S2 (500v, 1hr, 500vhs, step)
S3 (1000v, 1hr, 1000vhs, step)
S4 (8000v, 0.5hr, 2250vhs, Grad)
S5 (8000v, 5hr, 40000vhs, step) 共計(jì)44110vhs, 19.5小時(shí),其中S1用于泡脹水化膠條，S2和S3用于去小離子，S4和S5用于聚焦。
4) 平衡
用鑷子夾出膠條,超純水沖洗后，在濾紙上吸干（膠面，即接觸樣品那一面不能接觸濾紙，如果為18cm的膠條要將兩頭剪去），再以超純水沖洗，濾紙吸干（再次沖洗過程也可省略），然后用鑷子夾住膠條以正ji端（即酸性端）向下，負(fù)ji端（即堿性端）向上，放入用來平衡的試管中（鑷子所夾的是堿性端，酸性端留有溴酚蘭作為標(biāo)記），用平衡液A，平衡液B先后平衡15min。 注:平衡時(shí)要注意保持膠面始終向上,不能接觸平衡管壁。
平衡第二次時(shí)，在沸水中煮Marker 3min,剪兩個(gè)同樣大小的小紙片，長度與一向膠條的寬度等同，然后吸取煮好的Marker，轉(zhuǎn)入SDS—PAGE膠面上，保持緊密貼合；同樣在第二次平衡時(shí)，煮5%的瓊脂糖10ml。
4. 雙向電泳第二向---SDS-PAGE
1) 配膠(兩根膠條所用劑量)
分離膠：（T=8% 80 ml）：溶液于真空機(jī)中抽氣后再加APS和TEMED
30 % 丙烯酰胺儲液 21.28ml
分離膠buffer 20ml 10%APS 220ul TEMED 44 ul
雙蒸水 38.72ml
濃縮膠：（T=4.8% 10ml）
30 % 丙烯酰胺儲液 1.6ml
濃縮膠buffer 2.5ml 10%APS 30ul TEMED 5ul
雙蒸水 5.9ml
2) 灌膠
將玻璃板洗凈后,室溫晾干,然后,將電泳槽平衡好,玻璃板夾好,再在玻璃板底部涂上凡士林以防漏膠,倒入正丁醇壓膠,凝膠后(這時(shí)會出現(xiàn)三條線),用注射器吸去正丁醇,超純水洗兩次,再用濾紙除水后,倒入濃縮膠,正丁醇壓膠,凝膠后,用注射器吸去正丁醇,超純水洗兩次,再加入超純水,用保險(xiǎn)膜封好。
3) 轉(zhuǎn)移
剪兩個(gè)小的濾紙片，吸取Marker后，放入SDS—PAGE膠面的一端。然后，將平衡好的IPG膠條貼靠在玻璃板上,加少量的5%的瓊脂糖溶液在膠面上(瓊脂糖凝膠在轉(zhuǎn)移前。。。10幾分鐘的時(shí)候配好,水浴加熱溶解,并保持燒杯中水處于沸騰狀態(tài),至用之前再拿出來),再將IPG膠條緩緩加入SDS—PAGE膠面,其中不斷補(bǔ)加5%的瓊脂糖溶液,注意不能產(chǎn)生氣泡。
4) 跑膠
濃縮膠 13mA 分離膠 20mA 共約5.5個(gè)小時(shí)。
5. 銀染(兩根膠條所用劑量)（銀染特別注意用超純水）
1) 固定 30min 無水乙醇 200ml 乙酸50ml，用超純水定容至500ml。
2) 敏化 30min 無水乙醇 150ml。
Na2S2O3?5H2O 1.5688g
無水乙酸鈉 34g
先用水溶解Na2S2O3?5H2O和乙酸鈉,再加乙醇,最后定容至500ml。
3) 洗滌 5min × 3次
4) 銀染 20min AgNO3 1.25g 用超純水定容至500ml
5) 洗滌 1min × 2次
6) 顯影
無水Na2CO3 12.5g 用超純水定容至500ml，甲醛(37%)0.1ml, 臨時(shí)加。
7) 終止 10min EDTA—Na2?2H2O 7.3g 用超純水定容至500ml。
8) 洗滌 5min × 3次。
注意事項(xiàng)
整個(gè)雙向電泳實(shí)驗(yàn)中全部使用超純水，盡量減少離子的影響。
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