你知道什么是微生物檢驗嗎?你對微生物檢驗了解嗎?下面是遠慕生物為大家?guī)淼年P(guān)于微生物檢驗必須要知道的三大耐藥機制的知識，一起了解下吧。

　　一、產(chǎn)生滅活抗生素的各種酶

　　1、 β—內(nèi)酰胺酶(β-lactamase)

　　β—內(nèi)酰胺類抗生素都共同具有一個核心β—內(nèi)酰胺環(huán)，其基本作用機制是與細菌的青霉su結(jié)合蛋白結(jié)合，從而抑制細菌細胞壁的合成。產(chǎn)生β—內(nèi)酰胺酶是細菌對β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物產(chǎn)生耐藥的主要原因。細菌產(chǎn)生的β-內(nèi)酰胺酶，可借助其分子中的絲an酸活性位點，與β—內(nèi)酰胺環(huán)結(jié)合并打開β—內(nèi)酰胺環(huán)，導(dǎo)致藥物失活。迄今為止報道的β—內(nèi)酰胺酶已超過300種，1995年Bush等將其分為四型：第1型為不被克拉維酸抑制的tou孢菌su酶;第2型為能被克拉維酸抑制的β-內(nèi)酰胺酶;第3型為不被所有β—內(nèi)酰胺酶抑制劑抑制的金屬β-內(nèi)酰胺酶(需Zn2+活化)?？杀灰?胺四乙酸和P-chloromercuribenzate所抑制;第4型為不被克拉維酸抑制的青霉su酶。臨床常見的β—內(nèi)酰胺酶有超廣譜β—內(nèi)酰胺酶、tou孢菌su酶(AmpC酶)和金屬酶。

　　(1)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(Extended-Spectrumβ-lactamases,ESBLs)

　　ESBLs是一類能夠水解青霉su類、tou孢菌su類及單環(huán)類抗生素的β—內(nèi)酰胺酶，屬Bush分型中的2型β—內(nèi)酰胺酶，其活性能被某些β—內(nèi)酰胺酶抑制劑(棒酸、舒巴坦、他唑ba坦)所抑制。ESBLs主要由普通β-內(nèi)酰胺酶基因(TEM—1，TEM—2和SHV—1等)突變而來，其耐藥性多由質(zhì)粒介導(dǎo)。自1983年在德國shou次發(fā)現(xiàn)ESBLs以來，目前已報道的TEM類ESBIs已有90多種，SHV類ESBLs多于25種。TEM型和SHV型ESBLs主要發(fā)現(xiàn)于肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌，亦發(fā)現(xiàn)于變形桿菌屬、普羅威登斯菌屬和其他腸桿菌科細菌。

　　國內(nèi)近年來隨著三代tou孢菌su的廣泛使用，產(chǎn)ESBLs菌的檢出率逐年增加。NCCLs規(guī)定，凡臨床分離的大腸埃希氏菌和克雷伯氏菌均應(yīng)監(jiān)測是否為產(chǎn)ESBLs菌株;若產(chǎn)生，無論體外對第三代頭抱菌素、氨qu南的藥敏結(jié)果如何，均應(yīng)報告對三代tou孢菌su及氨qu南耐藥。另外，ESBLs菌株不僅對β-內(nèi)酰胺類抗生素有很高的耐藥率，而且對氨基糖苷類、喹喏酮類耐藥率也在60%左右，因此，臨床遇到由ESBLs引起的感染時，建議shou選含β—內(nèi)酰胺酶抑制劑的復(fù)方抗生素制劑或亞an培南;對于tou孢吡肟等四代tou孢，尚有爭議，根據(jù)抗菌藥的PK/PD理論，適當改變給藥劑量和給藥間隔。以使血藥濃度超過細菌MIC的時間達40%給藥間隔以上，或許是有效的。

　　(2)tou孢菌su酶(AmpC酶)屆Bush分類中的1型(Ⅰ型) β—內(nèi)酰胺酶。

　　通常將其分為由染色體介導(dǎo)產(chǎn)生的AmpC β—內(nèi)酰胺酶和由質(zhì)粒介導(dǎo)產(chǎn)生的AmpC β—內(nèi)酰胺酶，前者的產(chǎn)生菌有陰溝腸桿菌、銅綠假單胞菌等，后者主要由肺炎克雷伯氏菌和大腸埃希氏菌產(chǎn)生。AmpC酶可作用于大多數(shù)青霉su，第一、二、三代tou孢菌su和單環(huán)類抗生素。而第四代tou孢菌su、碳青霉烯類不受該酶作用。該酶不能被β—內(nèi)酰胺酶抑制劑所抑制。AmpCβ—內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生有2種可能：①在誘導(dǎo)劑存在時暫時高水平產(chǎn)生，當誘導(dǎo)劑不存在時，酶產(chǎn)量隨之下降，三代tou孢菌su、棒酸和碳青霉烯類抗生素是誘導(dǎo)型AmpC酶的強誘導(dǎo)劑;②染色體上控制酶表達的基因發(fā)生突變，導(dǎo)致AmpC酶持續(xù)穩(wěn)定高水平表達。由高產(chǎn)AmpC酶耐藥菌引起的感染死亡率很高。

　　實際上，所有的革蘭氏陰性菌都能產(chǎn)生染色體介導(dǎo)的AmpCtou孢菌su酶，在多數(shù)情況下為低水平表達;在腸桿菌、檸檬酸桿菌、沙雷shi菌、銅綠假單胞菌中可高頻誘導(dǎo)產(chǎn)生，且常為高產(chǎn)突變株。當臨床出現(xiàn)上述細菌感染，開始幾天三代tou孢菌su治療敏感，而隨后發(fā)生耐藥時，我們可懷疑為高產(chǎn)AmpC酶的細菌感染，四代tou孢菌su和碳青霉烯類抗生素不受具影響，可供臨床選用。含酶抑制劑的復(fù)方制劑不能用于治療產(chǎn)AmpC酶菌株的感染。

　　(3)金屬酶(metalloβ-1actamase)

　　大部分β-內(nèi)酰胺酶的活性位點是絲an酸殘基，但也有一小部分活性位點為金屬離子的酶類。第一個發(fā)現(xiàn)的以金屬離子為活性中心的酶是由蠟樣芽抱桿菌產(chǎn)生的tou孢菌su酶，能被EDTA所抑制，之后世界各地均發(fā)現(xiàn)了能產(chǎn)生這類酶的各種細菌。1988年Bushshou次將該酶定名為金屬β-內(nèi)酰胺酶(metalloβ-1actamase)，簡稱金屬酶。金屬β-內(nèi)酰胺酶耐受β—內(nèi)酰胺酶抑制劑且可水解幾乎所有β—內(nèi)酰胺類抗生素(包括亞an培南)。該酶已在氣單胞菌、嗜麥芽窄食單胞菌、洋蔥伯克霍爾德氏菌中發(fā)現(xiàn)，其中嗜麥芽窄食單胞菌的亞an培南耐藥性由染色體介導(dǎo)，而脆弱擬桿菌、肺炎克雷伯氏菌、銅綠假單胞菌中質(zhì)粒介導(dǎo)的突變株在日本已有報道。由粘質(zhì)sha雷氏菌產(chǎn)生的金屬β—內(nèi)酰胺酶IMP-1型可在類似接合子的intl3上移動，已經(jīng)傳播到銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯氏菌和產(chǎn)堿桿菌。金屬酶可以水解碳青霉烯類和最近開發(fā)的第四代tou孢菌su。金屬β-內(nèi)酰胺酶有廣泛傳播的潛力，對幾乎所有的β—內(nèi)酰胺類抗生素均具有水解活性，是目前所知的最qiang的β-內(nèi)酰胺酶-。

　　2、氨基糖甙修飾酶(或鈍化酶/滅活酶)

　　在細菌對氨基糖甙類抗生素產(chǎn)生耐藥的機制中，修飾酶介導(dǎo)的耐藥最wei流行，酶促修飾的氨基糖甙類抗生素不能與核糖體靶位作用，因此失去抗菌活性。修飾酶主要包括乙酰轉(zhuǎn)移酶、磷酸轉(zhuǎn)移酶和核苷轉(zhuǎn)移酶。三類氨基糖苷修飾酶的作用機制各不相同：乙酰轉(zhuǎn)移酶(AAC)修飾依賴于乙酰fu酶A的N-乙?；毫姿徂D(zhuǎn)移酶(APH)修飾依賴于ATP的O-磷酸化;核苷酸轉(zhuǎn)移酶(ANT)修飾依賴于ATP的腺苷化。在革蘭氏陰性病原菌中，最常見的氨基糖苷修飾酶是AAC(6’)，使氨基糖苷類抗生素1—、3—、2’—或6'—位乙?；?，如今已發(fā)現(xiàn)16種編碼AAC(6’)的基因。銅綠假單胞菌和腸桿菌科細菌趨向于產(chǎn)生AAC(3)、AAC(6’)、ANT(2’’)以及APH(3’);葡萄球菌和糞腸球菌經(jīng)常產(chǎn)生ANT(4’)(4’’)或雙功能的AAC(6’)/APH(2")。葡萄球菌對慶大霉su、卡那霉su和妥布霉su的`耐藥性和腸球菌的高度慶大霉su耐藥性通常由雙功能酶介導(dǎo)，這些酶通常(但非總是)由位于多重耐藥質(zhì)粒上的轉(zhuǎn)座子(Tn924)編碼，如葡萄球菌具有的轉(zhuǎn)座子Tn5405編碼的APH(3’)(提供卡那霉su、新霉su和阿米ka星耐藥性)，而其他的定位于染色體。越來越多的菌株可產(chǎn)生2種或更多種酶，對抗氨基糖苷類抗生素。在過去幾年里常見的組合是慶大霉su修飾酶ANT(2’’)和AAC(3)]與AAC(6’)結(jié)合，導(dǎo)致對慶大霉su、妥布霉su、耐替米星、卡那霉su和阿米ka星的廣譜耐藥性。

　　氨基糖苷類抗生素對非發(fā)酵菌、腸桿菌科及一些革蘭氏陽性球菌均有很好的抗菌活性，與β—內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)用有協(xié)同抗菌作用，在感染治療中占有重要地位。但由于以上耐藥機制的存在，細菌耐藥問題也日趨嚴重，應(yīng)該引起重視，可喜的是阿米ka星等對MRSA和產(chǎn)ESBLs菌株仍保持17%-40%的敏感率。

　　二、改變藥物作用靶位

　　1、 青霉su結(jié)合蛋白(PBP)的改變導(dǎo)致的β—內(nèi)酰胺類抗生素耐藥

　　青霉su結(jié)合蛋白(PBP)參與了肽聚糖合成的最后階段。高分子量PBP常常為多模塊，具有N末端糖基轉(zhuǎn)移酶區(qū)和C末端轉(zhuǎn)肽酶區(qū)。轉(zhuǎn)肽酶區(qū)的活性位點絲an酸與酶的天然結(jié)構(gòu)相仿，可與與β—內(nèi)酰胺類抗生素發(fā)生不可逆?；Ｇ嗝箂u結(jié)合蛋白(PBP)的改變常導(dǎo)致如下兩種臨床重要的耐藥表型。

　　(1)耐甲氧xi林金黃se葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus arueus,MRSA)

　　MRSA是20世紀60年代英國首先報道的一種嚴重的臨床耐藥致病菌,20世紀80年代以來，世界各地都相繼發(fā)生MRSA醫(yī)院感染的暴發(fā)流行，并逐年增多。MRSA耐藥分為固有耐藥和獲得性耐藥，固有耐藥是由染色體介導(dǎo)的，其耐藥性的產(chǎn)生是因為細菌產(chǎn)生一種特殊的青霉su結(jié)合蛋白PBP2a(或PBP2’)，分子量為78000的蛋白質(zhì)，與β內(nèi)酰胺類抗生素的親和力減低，從而導(dǎo)致細菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥。PBP2a由mecA基因編碼，95%以上的MRSA菌株能檢測到mecA基因，而敏感株則無。獲得性耐藥是由質(zhì)粒介導(dǎo)的，細菌獲得耐藥基因后，產(chǎn)生大量β-內(nèi)酰胺酶(而不是PBPs)，使耐酶青霉su緩慢失活，表現(xiàn)出耐藥性，多為臨界耐藥。

　　在MRSA檢測過程中，凡屬MRSA，不管其對其他β-內(nèi)酰胺類抗生素MIC值或抑菌圈的大小，實驗室均應(yīng)向臨床報告為對所有青霉su類、tou孢菌su類、碳青霉烯類、碳tou孢烯類和β內(nèi)酰胺類—酶抑制劑復(fù)合制劑耐藥，以免誤導(dǎo)臨床用藥。MRSA感染的治療是臨床十分棘手的難題之一，關(guān)鍵是其對許多抗生素具有多重耐藥性，萬古霉su是目前臨床上治療MRSA療效肯定的抗生素，應(yīng)用30多年來未發(fā)現(xiàn)耐藥菌株。

　　(2) 耐青霉su肺炎鏈球菌 (Penicillin resistant Streptococcus pneumoniae,PRSP)

　　長期以來肺炎鏈球菌對青霉su高度敏感。MIC在0.005-0.01mg/L之間。1967年澳大利亞shou次報道耐青霉su肺炎鏈球菌,MIC為0.5mg/L，此后世界許多國家和地區(qū)均有報道，且耐藥率迅速上升。PRSP的耐藥機制肺炎鏈球菌的青霉su結(jié)合蛋白(PBP)發(fā)生改變，使其與青霉su的親和力減低。肺炎鏈球菌有6種PBP：1a、1b、2x、2a、2b和3，其中PBP2b最為重要，如果青霉su結(jié)合到PBP2b上并使之抑制即導(dǎo)致細菌溶解和死亡;反之，PBP2b發(fā)生突變，青霉su不能產(chǎn)生作用，則導(dǎo)致PRSP。在PRSP高耐菌株中(MIC≥2μg/m1)可有多達4種PBP(主要是1a、1b、2x、2b)同時發(fā)生改變[7]。

　　肺炎鏈球菌是引起社區(qū)獲得性肺炎的重要致病菌。目前，國內(nèi)PRSP的發(fā)生率在4%左右，明顯低于歐洲國家，在亞洲也屬于中等水平，且MIC多小于1mg/L，因此，在社區(qū)獲得性肺部感染病原菌中，PRSP尚不構(gòu)成嚴重威脅，青霉su仍可作為shou選治療藥物。但是耐藥沒有國界，中國日前PRSP發(fā)生率尚低.但決不意味著不要重視，而是應(yīng)該進一步加強PRSP的耐藥監(jiān)測。對于PRSP感染臨床治療推薦使用tou孢噻肟/tou孢曲松、新喹諾酮類(如司pa沙星)。若屬PRSP嚴重感染則需應(yīng)用萬古霉su或加用li福平。

　　2、 DNA拓撲異構(gòu)酶的改變引起喹諾酮類抗生素耐藥

　　喹諾酮類藥物的作用機制主要是通過抑制DNA拓撲異構(gòu)酶而抑制DNA的合成，從而發(fā)揮抑菌和殺菌作用。細菌DNA拓撲異構(gòu)酶有I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，喹諾酮類藥物的主要作用靶位是拓撲異構(gòu)酶Ⅱ和拓撲異構(gòu)酶Ⅳ。拓撲異構(gòu)酶Ⅱ又稱DNA促旋酶，參與DNA超螺旋的形成，拓撲異構(gòu)酶Ⅳ則參與細菌子代染色質(zhì)分配到子代細菌中。革蘭氏陰性菌中DNA促旋酶是喹諾酮類的第一靶位，而革蘭氏陽性菌中拓撲異構(gòu)酶Ⅳ是第一靶位。

　　當編碼組成DNA促旋酶的A亞單位和B亞單位及組成拓撲異構(gòu)酶Ⅳ的parC和parE亞單位中任一亞基的基因發(fā)生突變均可引起喹諾酮類的耐藥性。在所有的突變型中，以gyrA的突變?yōu)橹鳎?0%左右，其次是gyrB、parC和parE突變。在所有這些突變類型中，若Ⅱ型拓撲異構(gòu)酶上存在2個突變點(如gyrA和parC上)，它們引起對氟kui諾酮類的耐藥遠遠大于只有一個突變點(如gyrA或gyrB上)，前者是后者的3-4倍。同時沒有發(fā)現(xiàn)突變僅出現(xiàn)在parC基因這一現(xiàn)象。這可能是因為DNA促旋酶是氟kui諾酮類的重要靶位,gyrA亞單位的改變可引起酶結(jié)構(gòu)發(fā)生變化致空間位障，阻止喹諾酮類進入喹諾酮類作用區(qū)，或引起物理化學變化，干擾喹諾酮與酶的相互作用。這些結(jié)果顯示gyrA上突變的出現(xiàn)是引起細菌對喹諾酮類發(fā)生耐藥的主要機制，而parC突變只是進一步引起銅綠假單胞菌對喹諾酮的高度耐藥。

　　DNA拓撲異構(gòu)酶的改變是細菌耐喹諾酮類抗菌藥的主要機制，其他耐喹諾酮類的機制還包括后面將要談到的細菌膜通透性改變和主動外排機制。

　　三、細胞膜透性屏障和抗生素主動外排泵

　　細菌可以通過細胞壁的障礙或細胞膜通透性的改變，形成一道有效屏障，使得抗生素無法進入細胞內(nèi)并達到作用靶位而發(fā)揮抗菌效能，這也是細菌在進化與繁殖過程中形成的一種防衛(wèi)機制。這類耐藥機制是非特異性的，主要見于革蘭氏陰性菌。因為革蘭氏陰性菌細胞壁粘肽層外面存在著類脂雙層組成的外膜，外層為脂多糖，由緊密排列的碳氮分子組成，阻礙了疏水性抗菌藥進入菌體內(nèi)。另外細菌外膜上還存在著多種孔蛋白，分子較大者為OmpF，分子較小者為OmpC，它們可形成特異性通道(OprD)和非特異性的通道(OprF)，作為營養(yǎng)物質(zhì)和親水性抗菌藥物的通道。抗菌藥物分子越大，所帶負電荷越多，疏水性越強，則不易通過細菌外膜。細菌發(fā)生突變失去某種特異孔蛋白后即可導(dǎo)致細菌耐藥性,另外由于外膜蛋白OprF的缺失，使藥物不易通過而產(chǎn)生耐藥性。如銅綠假單胞菌特異性孔蛋白OprD2缺失即導(dǎo)致碳青霉烯類抗生素耐藥。

　　另外一種導(dǎo)致細菌非特異性耐藥的機制是細菌主動外排泵的存在，可以將進入細菌體內(nèi)的藥物泵出膜外，從而逃避抗生素的作用。主動外排系統(tǒng)由于能特異地將進入細胞內(nèi)的多種抗菌藥物主動泵出細胞外，導(dǎo)致細胞獲得耐藥性。如大腸埃希氏菌中的多藥外排泵AcorAB-TolC系統(tǒng)可以導(dǎo)致細菌對包括四環(huán)素、氯霉su、紅霉su、β—內(nèi)酰胺類、li福平、氟kui諾酮類、氧化劑、有機溶劑、堿性染料等多種結(jié)構(gòu)不相關(guān)的藥物耐藥。銅綠假單胞菌的MexAB-OprM系統(tǒng)的主動外排作用也是導(dǎo)致銅綠假單胞菌固有的多重耐藥性的重要因素之一。

　　細菌的膜耐藥機制主要表現(xiàn)在銅綠假單胞菌的多藥耐藥性。銅綠假單胞菌幾乎囊括了包括膜耐藥在內(nèi)的所有細菌耐藥機制，其耐藥已成為當前感染治療中較為棘手的問題之一，尤其值得重視和研究。