聚焦蛋白質(zhì)互作研究進展與實驗方法

研究蛋白-蛋白相互作用是理解生命活動的基礎。蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡是生物信息調(diào)控的主要實現(xiàn)方式，是決定細胞命運的關(guān)鍵因素。檢測蛋白質(zhì)間相互作用的實驗方法有哪些？這些檢測方法各有什么優(yōu)缺點?總結(jié)如下。

1. 生化方法

●共純化、共沉淀，在不同基質(zhì)上進行色譜層析(需要補充)

●蛋白質(zhì)親和色譜 基本原理是將一種蛋白質(zhì)固定于某種基質(zhì)上(如Sepharose)，當細胞抽提液經(jīng)過改基質(zhì)時，可與改固定蛋白相互作用的配體蛋白被吸附，而沒有吸附的非目標蛋白則隨洗脫液流出。被吸附的蛋白可以通過改變洗脫液或者洗脫條件而回收下來。

GST pull down技術(shù)：為了更有效的利用蛋白質(zhì)親和色譜，可以將待純話的蛋白以融合蛋白的形式表達，即將"誘餌“蛋白與一種易于純化的配體蛋白融合。例如與GST融合的蛋白再經(jīng)過GSH的色譜柱時，就可以通過GST和GSH的相互作用而被吸附。當載有細胞抽提物經(jīng)過柱時，就可以得到能夠與“誘餌"蛋白相互作用的目標蛋白了。

Epitope-tag技術(shù)：表位附加標記技術(shù) 就是將附加的抗原 融合到目的蛋白以檢測目的蛋白的表達，同時還可以通過親和層析法來純化目的蛋白。 缺點：表位附加標記可能會使融合蛋白不穩(wěn)定，改變或使融合蛋白功能喪失。

以上兩種方法都要共同的缺點：假陽性。實驗所檢測到的相互作用可能時由蛋白質(zhì)所帶電荷引起的，并不是生理性的相互作用;蛋白的相互作用可能并不是直接的，可是由第三者作為中介的;有時會檢測到兩種在細胞中不可能相遇卻有ji強親和力的蛋白。因此實驗結(jié)果還應經(jīng)其他方法驗證。

●免疫 共沉淀 免疫共沉淀是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。改法的優(yōu)點是蛋白處于天然狀態(tài)，蛋白的相互作用可以在天然狀態(tài)下進行，可以避免認為影響;可以分離得到天然狀態(tài)下相互作用的蛋白復合體。 缺點：免疫共沉淀同樣不能保證沉淀的蛋白復合物時候為直接相互作用的兩種蛋白。另外靈敏度不如親和色譜高。

●Far-Western 又叫做親和印記。將PAGE膠上分離好的凡百樣品轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，然后檢測哪種蛋白能與標記了同位素的誘餌蛋白發(fā)生作用，最后顯影。 缺點是轉(zhuǎn)膜前需要將蛋白復性。

2. 等離子表面共振技術(shù)(Surface plasmon resonance)

該技術(shù)是將誘餌蛋白結(jié)合于葡聚糖表面，葡聚糖層固定于幾十納米厚的技術(shù)膜表面。當有蛋白質(zhì)混合物經(jīng)過時，如果有蛋白質(zhì)同“誘餌"蛋白發(fā)生相互作用，那么兩者的結(jié)合將使金屬膜表面的折射綠上升，從而導致共振角度的改變。而共振角度的改變與該處的蛋白質(zhì)濃度成線性關(guān)系，由此可以檢測蛋白質(zhì)之間的相互作用。該技術(shù)不需要標記物和染料，安全靈敏快速，還可定量分析。缺點：需要專門的等離子表面共振檢測儀器。

3. 遺傳學方法

使某處發(fā)生缺損，檢測對其他地方的影響。

●基因外抑制子?；蛲庖种谱邮峭ㄟ^一個基因的突變 來彌補原有基因的突變。比如相互作用的蛋白A和B，如果A發(fā)生了突變使兩者不再相互作用，此時B如果再發(fā)生彌補性突變就可以使兩者的相互作用恢復，那么B就是A的基因外抑制子。 缺點：需要知道基因，要有表型，篩選抑制子比較費時。

●合成致死篩選 指兩個基因同時發(fā)生突變會產(chǎn)生致死效應，而當每個基因單獨發(fā)生突變時則無致死效應。用于分析兩個具有相同重要蛋白之間的相互作用。

4. 雙雜交技術(shù)

原理基于真核細胞轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特殊性，這些轉(zhuǎn)錄因子通常需要兩個或以上相互獨立的結(jié)構(gòu)域組成。分別使結(jié)合域和激活域同誘餌蛋白和獵物蛋白形成融合蛋白，在真核細胞中表達，如果兩種蛋白可以發(fā)生相互作用，則可使結(jié)合域和激活域在空間上充分接近，從而激活報告基因。 缺點：自身有轉(zhuǎn)錄功能的蛋白會造成假陽性。融合蛋白會影響蛋白的真實結(jié)構(gòu)和功能。不利于核外蛋白研究，會導致假隱性。

5. 熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)

指兩個熒光法色基團在足夠近(<100埃)時，它們之間可發(fā)生能量轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象。熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)可以研究分子內(nèi)部對某些刺激發(fā)生的構(gòu)象變化，也能研究分子間的相互作用。它可以在活體中檢測，非常靈敏，分辯率高，能夠檢測大分子的構(gòu)象變化，能夠定性定量的檢測相互作用的強度。 缺點 此項技術(shù)要求發(fā)色基團的距離小于100埃。另外設備昂貴，還需要融合GFP給蛋白標記。

此外還有交聯(lián)技術(shù)(cross-linKing)，蛋白質(zhì)探針技術(shù)，噬菌體展示技術(shù)(Phage display)以及生物信息學的方法來檢測蛋白質(zhì)之間相互作用。