在做慢病毒包裝實(shí)驗(yàn)中，大家是不是經(jīng)常遇到：用同樣的病毒載體系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，為什么有人做的很好，次次成功，有人卻是時(shí)常做不出來(lái)，穩(wěn)定性很差，不是滴度低就是根本不出毒？

今天遠(yuǎn)慕生物就把10年的病毒包裝經(jīng)驗(yàn)總結(jié)給大家，首先我們來(lái)簡(jiǎn)要介紹下慢病毒包裝的流程：

影響慢病毒包裝是否成功的因素有很多，例如：細(xì)胞狀態(tài)、質(zhì)粒比例、質(zhì)粒抽提純化情況、轉(zhuǎn)染試劑和條件、目的基因本身的影響等等。我們?cè)敿?xì)列出了如下幾點(diǎn)。

1.實(shí)驗(yàn)材料的選擇

我們進(jìn)行慢病毒包裝時(shí)要重視實(shí)驗(yàn)材料——建議使用商品化的成熟毒載體系統(tǒng)，遠(yuǎn)慕生物慢病毒包裝三質(zhì)粒系統(tǒng)為：psPAX2, pMD2.G 及 pHBLV系列質(zhì)粒。包裝細(xì)胞293T細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)要讓它“白白胖胖、活力充沛"。并且要定期純化包裝細(xì)胞、檢測(cè)表達(dá)質(zhì)粒。

2、目的基因?qū)β《景b的影響

目的基因的大小、序列情況、目的蛋白的功能毒性等都有可能導(dǎo)致包裝失敗。一般慢病毒包裝的目的片段大小在2.5k以?xún)?nèi)較為合適，大于2.5k會(huì)降低滴度或超過(guò)載體容量無(wú)法包裝。并且，可能存在一些基因表達(dá)翻譯后對(duì)包裝細(xì)胞產(chǎn)生毒性，導(dǎo)致細(xì)胞狀態(tài)異常，無(wú)法完成病毒包裝，這種情況我們可以嘗試更換病毒包裝系統(tǒng)，例如選擇包裝腺病毒。

3、載體構(gòu)建和抽提純化環(huán)節(jié)

載體構(gòu)建時(shí)我們需要注意是否存在以下情況：質(zhì)粒載體重組、某個(gè)部件缺失、污染別的質(zhì)?；螂s物、中抽純化污染等。要養(yǎng)成同時(shí)做陰性對(duì)照的習(xí)慣：目的基因載體和陰性對(duì)照GFP 載體是同一批，且每次包裝都如此操作。要保證目的基因的表達(dá)載體構(gòu)建純化良好，質(zhì)粒間比例得當(dāng)，建議三質(zhì)粒包裝系統(tǒng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染時(shí)的摩爾比為1：1：1。

4、細(xì)胞轉(zhuǎn)染及病毒收集階段

細(xì)胞出毒期間過(guò)程中的細(xì)胞活力是包裝成功及病毒滴度高低的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，進(jìn)行包裝轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞前一定要重視細(xì)胞是否干凈、飽滿(mǎn)立體感是否好、鋪板是否均勻，細(xì)胞密度在50-60%時(shí)進(jìn)行包裝比較合適。在24、48 小時(shí)的要觀察細(xì)胞及熒光狀態(tài)，判斷是否正常，轉(zhuǎn)染后48h和72h分別兩次收集病毒上清(48h收集后置換新鮮培液)。

當(dāng)然，最重要的是，在進(jìn)行慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞時(shí)，使用遠(yuǎn)慕生物慢病毒包裝專(zhuān)用轉(zhuǎn)染試劑：LentiFit。效率高、毒性低，血清的存在不影響轉(zhuǎn)染效率，讓你的細(xì)胞在包裝慢病毒時(shí)“又圓又胖"，大大提高了慢病毒包裝的成功率。