WB 是檢測(cè)和定量磷酸化蛋白質(zhì)的重要實(shí)驗(yàn)方法，然而大家一直都說(shuō)磷酸化蛋白 WB 不好做！這是因?yàn)樘幱诓煌募?xì)胞生長(zhǎng)狀況和 / 或特定的細(xì)胞周期時(shí)，磷酸化蛋白可能僅占細(xì)胞總蛋白中的一小部分，處理不得當(dāng)時(shí)，還會(huì)快速的去磷酸化。

磷酸化蛋白質(zhì) WB 做不好的原因有許多，比如封閉問(wèn)題，抗體問(wèn)題，或所需的磷酸化蛋白可能不存在于樣品中或者低于 WB 檢測(cè)的量。然而，有一個(gè)常被大家忽視的重要原因就是蛋白樣品制備所用的方法是否適合于磷酸化蛋白的提??？

其實(shí)蛋白質(zhì)提取的方法不僅影響提取效率，還會(huì)影響蛋白的質(zhì)量。大家目前常用的方法是利用溶液法進(jìn)行蛋白提?。ㄈ?RIPA 裂解液），但是往往會(huì)在蛋白質(zhì)提取中產(chǎn)生兩個(gè)不同的組分，即 RIPA 可溶性和 RIPA 不可溶性組分。

通常 RIPA 不可溶性組分被我們直接丟棄忽略。但是已經(jīng)有文章證實(shí)許多蛋白質(zhì)存在于被丟棄的 RIPA 不可溶性組分中 。也就是說(shuō)利用溶液法提取的并非是完整的總蛋白，而僅僅是一些可溶性蛋白。

那使用 RIPA 等溶液法提取的不完整總蛋白做實(shí)驗(yàn)，到底會(huì)不會(huì)影響我們磷酸化蛋白檢測(cè)和定量研究呢？我們來(lái)一起討論下。

1、將細(xì)胞裂解物分離成 RIPA 可溶性和 RIPA 不可溶性組分，發(fā)現(xiàn)在兩個(gè)組分中都可以檢測(cè)到 TDP-43 的磷酸化片段。同樣的，用 RIPA 緩沖液裂解小鼠 MEC 細(xì)胞時(shí)，磷酸化的 EGFR（pY-1068 EGFR）只在 RIPA 可溶性組分中檢測(cè)出。

然而，磷酸化的 c-Src（pY-416 c-Src）則在 RIPA 可溶性和 RIPA 不可溶組分中都能檢測(cè)出， 甚至 WT 樣品在 RIPA 不可溶組分中的信號(hào)比 RIPA 可溶性組分中更強(qiáng)，結(jié)果表明如果僅使用 RIPA 可溶性組分進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，則磷酸化 c-Src 丟失  。就是說(shuō)使用溶液法提取的蛋白譜是不完整的，蛋白有非等比例的丟失，內(nèi)參也有可能存在丟失情況，那么如果做磷酸化蛋白定量，就會(huì)出現(xiàn)數(shù)據(jù)偏差。

2、β整聯(lián)蛋白是一種磷酸化蛋白，使用 Chaps 進(jìn)行原代雞胚成纖維細(xì)胞蛋白質(zhì)提取，Chaps 不可溶組分使用 RIPA 裂解液再次提取，RIPA 不可溶組分再使用 sample buffer 提取，在五次采樣中，在 Chaps 不可溶組分和 RIPA 不可溶組分中都發(fā)現(xiàn)了大量的整聯(lián)蛋白 。

3、caveolin-1 的酪an酸磷酸化（P-Cav-1）被發(fā)現(xiàn)是由 p38 絲裂原活化激酶和 c-Src 激酶的激活介導(dǎo)的 。當(dāng)使用 Triton-X-100 和 RIPA 提取 NIH3T3 細(xì)胞時(shí)，在可溶性組分中未檢測(cè)到 caveolin 蛋白，僅在不可溶性部分 和（RIPA 不可溶組分但 SDS 可溶組分）中檢測(cè)到。 也就是說(shuō)如果在這種情況下使用 RIPA 可溶性組分來(lái)檢測(cè) P-Cav-1 將無(wú)法被檢出。

4、對(duì)于特定時(shí)間的特定樣品，磷酸化和非磷酸化蛋白質(zhì)的總和代表該特定蛋白質(zhì)的總量。在相同的 WB 檢測(cè)中， 磷酸化蛋白質(zhì)的量增加通常伴隨著非磷酸化蛋白質(zhì)的降低。

如果在蛋白質(zhì)提取過(guò)程中蛋白質(zhì)有一部分丟失，磷酸化和非磷酸化蛋白質(zhì)之間的比例則可能被改變，會(huì)導(dǎo)致數(shù)據(jù)偏差。 以下數(shù)據(jù)使用兩種不同的蛋白質(zhì)提取方法（SD-001，Invent Biotech, USA 基于柱式法的蛋白質(zhì)提取試劑盒與 RIPA 緩沖液，未公開(kāi)的數(shù)據(jù)）比較 p-stat-3 和 p-56 的磷酸化模式，（G.Szanda， NIH.NIAAA / LPS，USA）。

結(jié)果表明，對(duì)于 stat3 的磷酸化模式，處理（T）和基線水平（NT）樣品使用 SD-001(Invent Biotech, USA) 和 RIPA 緩沖液無(wú)明顯差異。 然而，p-56 的磷酸化模式的結(jié)果卻wan全不同。

使用 SD-001 的裂解物，磷酸化的 p-56 在化學(xué)刺激（T）后從基線水平（NT）增加，同時(shí)伴隨著非磷酸化形式的降低，而 RIPA 緩沖液提取的樣品恰恰相反。 處理的（T）樣品中的磷酸化 p-56 小于基線水平（NT）， 這個(gè)觀察結(jié)果與預(yù)期不一致。 雖然確切的原因不清楚，但是蛋白丟失是導(dǎo)致這個(gè)結(jié)果的最大可能原因。 除了提取過(guò)程中的蛋白質(zhì)損失外，還發(fā)現(xiàn) RIPA 緩沖液人為增加激酶活性并潛在地影響蛋白磷酸化  。

總結(jié)
磷酸化蛋白 WB 做不好，很可能的原因是不適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)提取方法影響了我們的研究。 因此，選擇適當(dāng)?shù)臉悠分苽浞椒▽?duì)于磷酸化蛋白的成功檢測(cè)和定量至關(guān)重要。Invent 利用柱式法進(jìn)行蛋白提取時(shí)，不產(chǎn)生不可溶性組分，無(wú)蛋白丟失，可以得到更準(zhǔn)確的結(jié)果。