純種分離

從混雜微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物分離與純化。在分子生物學的研究及應用中，不僅需要通過分離純化技術從混雜的天然微生物群中分離出特定的微生物，而且還必須隨時注意保持微生物純培養(yǎng)物的“純潔"，防止其他微生物的混入。

純種分離的目的是將目的菌從混雜的微生物中分離出來，獲得純培養(yǎng)。

如果樣品沒有經(jīng)增殖培養(yǎng)而直接進行分離，那么要得到具有某一特性的純種，就更該細致、謹慎的操作。

純種分離的常用方法有4種：

傾注平板分離法、涂布平板分離法、平板劃線分離法和組織分離法。

1、傾注平板分離法：培養(yǎng)后，在培養(yǎng)基內(nèi)部及表面形成單菌落。

傾注平板法:將無自生理鹽水稀釋后的樣品加入無茵培養(yǎng)基混合均勻。待凝固后倒置培養(yǎng)，內(nèi)部及表面形成單自落。

2、涂布平板分離法：培養(yǎng)后，在培養(yǎng)基表面形成單菌落。

因為將微生物懸液先加到較燙的培養(yǎng)基中再倒平板易造成某些熱敏感菌的死亡，且采用稀釋倒平板法也會使一些嚴格好氧菌因被固定在瓊脂中間缺乏氧氣而影響其生長，因此在微生物學研究中常用的純種分離方法是涂布平板法。

用途：一般多用于菌種的純化；

優(yōu)點：可以觀察菌落特征，對混合菌進行分離；

缺點：不能計數(shù)；

控制每個平板中微生物的菌落數(shù)在一定的范圍可獲得理想的分離效果，對于細菌和酵母，以每平板10~200菌落為佳，對于絲狀菌，則應控制每平板菌落數(shù)30~50或更少。

如果分離菌絲呈蔓延性生長的絲狀菌如根霉、毛霉等，則可以在培養(yǎng)基中添加0.1%左右的去氧膽酸鈉（去氧膽酸鈉在低PH下滅菌過程中易形成絮狀沉淀，可以通過分別滅菌、傾注平板前混合的方法避免）或山梨糖（在察氏培養(yǎng)基中加山梨糖0.1%，蔗糖0.01%），這樣可防止菌絲蔓延，便于挑取。

3、平板劃線分離法：能達到純種分離的目的。

經(jīng)培養(yǎng)后會得到呈分散狀態(tài)的單菌落純培養(yǎng)。

最/簡單的分離微生物的方法是平板劃線法，其原理是將微生物樣品在固體培養(yǎng)基表面多次作“由點到線"稀釋而達到分離目的的。劃線的方法很多，常見的比較容易出現(xiàn)單個菌落的劃線方法有斜線法、曲線法、方格法、放射法、四格法等。

用途：一般多用于篩選菌株；用于平板培養(yǎng)基的回收率計數(shù)。

優(yōu)點：可以計數(shù)，可以觀察菌落特征。

缺點：吸收量較少，較麻煩，平板不干燥效果不好，容易蔓延。如果菌液密度大的話，長不出單菌落。

4、組織分離法：適用于從子實體或罹病的植株上分離高等真菌或植物致病菌。

分離時，切取小塊受病組織，用10%漂白粉水或0.1%升/汞液進行表面消毒，并用無菌水洗滌數(shù)次后，移置于培養(yǎng)皿中的瓊脂培養(yǎng)基表面上，在適宜的溫度條件（25℃~26℃）培養(yǎng)。

受病組織內(nèi)潛伏的微生物開始生長，經(jīng)3~5天后，就可以看到從受病組織周圍長出菌絲，并向外擴展。

經(jīng)菌落特征的觀察和鏡檢，確認是所需分離的菌種時，即用火焰滅菌的接種針從邊緣挑取少量菌體，移到斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

與增殖培養(yǎng)一樣，在純種分離時同樣也要根據(jù)實際情況對培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分和培養(yǎng)條件進行適當?shù)目刂?，以獲得良好的分離效果。