【實(shí)驗?zāi)康摹?/span>

1.掌握葡聚糖凝膠的特性及凝膠層析的原理。

2．學(xué)習(xí)葡聚糖凝膠層析的基本操作技術(shù)。

【實(shí)驗原理】

凝膠層析又稱分子排阻層析或凝膠過濾，是以被分離物質(zhì)的分子量差異為基礎(chǔ)的一種層析分離技術(shù)，這一技術(shù)為純化蛋白質(zhì)等生物大分子提供了一種非常溫和的分離方法。層析的固定相載體是凝膠顆粒，目前應(yīng)用較廣的是：具有各種孔徑范圍的葡聚糖凝膠（Sephadex）和瓊脂糖凝膠（Sepharose）。

葡聚糖凝膠是由直鏈的葡聚糖分子和交聯(lián)劑3—氯1，2—環(huán)氧丙烷交聯(lián)而成的具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子化合物。凝膠顆粒中網(wǎng)孔的大小可通過調(diào)節(jié)葡聚糖和交聯(lián)劑的比例來控制，交聯(lián)度越大，網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)越緊密；交聯(lián)度越小，網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)就越疏松，網(wǎng)孔的大小決定了被分離物質(zhì)能夠自由出入凝膠內(nèi)部的分子量范圍。可分離的分子量范圍從幾百到幾十萬不等。

葡聚糖凝膠層析，是使待分離物質(zhì)通過葡聚糖凝膠層析柱，各個組分由于分子量不相同，在凝膠柱上受到的阻滯作用不同，而在層析柱中以不同的速度移動。分子量大于允許進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔范圍的物質(zhì)*被凝膠排阻，不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，阻滯作用小，隨著溶劑在凝膠顆粒之間流動，因此流程短，而先流出層析柱；分子量小的物質(zhì)可*進(jìn)入凝膠顆粒的網(wǎng)孔內(nèi)，阻滯作用大，流程延長，而最后從層析柱中流出。若被分離物的分子量介于*排阻和*進(jìn)入網(wǎng)孔物質(zhì)的分子量之間，則在兩者之間從柱中流出，由此就可以達(dá)到分離目的。

本實(shí)驗以葡聚糖凝膠G—25作為固定相載體，來分離藍(lán)色葡聚糖—2000和溴酚藍(lán)。藍(lán)色葡聚糖— 2000分子量接近2×106， 而溴酚藍(lán)分子量為670，二者分子量相差較大，前者*排阻，而后者則可*進(jìn)入凝膠顆粒網(wǎng)孔內(nèi)，二者通過層析柱的時間不同而分開。

【遠(yuǎn)慕實(shí)驗材料】

1.實(shí)驗器材

層析柱(1×20cm)附有一小段乳膠管及螺旋夾；洗脫液瓶(帶下口的三角瓶，250m1)；試管及試管架；量筒10m1；721型分光光度計

2.實(shí)驗試劑

(1) Tris—醋酸緩沖液 (pH7.0):取0.0lmol/L Tris溶液(含0.1mol/L KCl)900ml，用濃醋酸調(diào)pH至7.0，加蒸餾水至1000m1。

(2) 溴酚藍(lán)溶液：稱取溴酚藍(lán)10毫克，溶于5毫升乙醇中，充分?jǐn)嚢枋蛊淙芙猓缓笾鸬渭尤隩ris—醋酸緩沖液(pH7.0)至溶液呈深藍(lán)色。

(3) 藍(lán)色葡聚糖—2000溶液：稱取藍(lán)色葡聚糖—2000 10毫克，溶于2毫升Tris—醋酸緩沖液(pH7.0)中即成。

(4) 樣品溶液：取溴酚藍(lán)溶液0.1毫升，藍(lán)色葡聚糖—2000溶液0.5毫升混勻后為上柱樣品溶液。

(5)葡聚糖凝膠G- 25 (Sephadex-G-25)

【遠(yuǎn)慕實(shí)驗操作】

1.實(shí)驗?zāi)z的制備：商品凝膠是干燥的顆粒，使用時需經(jīng)溶脹處理，稱取4克葡聚糖凝膠G—25，加50毫升蒸餾水，攪拌均勻，在室溫溶脹6小時，或沸水浴溶脹 2小時，一般采用后一種方法。再用傾瀉法除去凝膠上層水及細(xì)小顆粒，用蒸餾水反復(fù)洗滌幾次，再以緩沖溶液(pH7.0的Tris—醋酸溶液)洗滌2—3次，使pH和離子強(qiáng)度達(dá)到平衡，最后抽去溶液及凝膠顆粒內(nèi)部氣泡，凝膠可保存在緩沖液內(nèi)。

2.裝柱：將層析柱洗凈，垂直固定在鐵支架上，選擇有薄膜端作為層析柱下口，將下口接上乳膠管并用螺旋夾夾緊。層析柱中加入洗脫液，打開下口螺旋夾，讓溶液流出，排除殘留氣泡，最后保留約2厘米高度的洗脫液，擰緊螺旋夾。將凝膠輕輕攪動均勻，用玻璃棒沿層析柱內(nèi)壁緩緩注入柱中，待凝膠沉積到柱床下已超過l厘米時，打開下口螺旋夾，繼續(xù)裝柱至柱床高度達(dá)到8厘米,關(guān)閉出口。裝柱過程中嚴(yán)禁產(chǎn)生氣泡，盡可能一次裝完，避免出現(xiàn)分層。再用洗脫液平衡l至2個柱床體積，凝膠面上始終保持有一定的洗脫液。平衡后，擰緊下端螺旋夾。

3.加樣品：打開螺旋夾使柱面上的洗脫液流出，直至床面與液面剛好平齊為止，關(guān)閉下端出口。取溴酚藍(lán)及藍(lán)色葡聚糖—2000混合液0.3毫升，小心地加于凝膠表面上，切勿攪動層析柱床表面。打開下端出口，使樣品溶液進(jìn)入凝膠內(nèi)，并開始收集流出液。當(dāng)樣品溶液恰好流至與凝膠表面平齊時，關(guān)閉下端出口。用少量洗脫液清洗層析柱加樣區(qū)，共洗滌三次，每次清洗液應(yīng)*進(jìn)入凝膠柱內(nèi)后，再進(jìn)行下一次洗滌。最后在凝膠表面上加入洗脫液，保持高度為3—4cm。

4.洗脫與收集：連接好凝膠柱層析系統(tǒng)，調(diào)節(jié)洗脫液流速為每分鐘1毫升，進(jìn)行洗脫。仔細(xì)觀察樣品在層析柱內(nèi)的分離現(xiàn)象，收集洗脫液，每收集3毫升即換一支收集管 (試管預(yù)先編號)，收集約20管左右，樣品即可*被洗脫下來。將各收集管中的洗脫液分別用721型分光光度計在波長540nm處測定其光密度。

5. 凝膠回收處理方法：將樣品*洗脫下來后，繼續(xù)用三倍柱床體積的洗脫液沖洗凝膠后，將柱下口放在小燒杯中，慢慢打開，再將上口慢慢松開，使凝膠全部回收至小燒杯中，備用。

【實(shí)驗結(jié)果】

以洗脫管號為橫坐標(biāo)，以光密度為縱坐標(biāo)作圖即得洗脫曲線。分析曲線圖并討論實(shí)驗結(jié)果。