一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛢?nèi)容

目的：1. 通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)的學(xué)習(xí)與操作，使學(xué)生在實(shí)驗(yàn)過(guò)程更好的理解SDS-聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）測(cè)定蛋白質(zhì)純度與分子量的原理與依據(jù)；

2. 要求學(xué)生掌握電泳原理以及SDS－PAGE垂直板電泳分離蛋白質(zhì)技術(shù)；

3. 熟悉垂直板電泳操作原理和方法，凝膠染色與脫色方法，凝膠圖譜的繪制與計(jì)算；

4. 了解在電泳中分子量標(biāo)準(zhǔn)物的使用。

內(nèi)容：1．SDS-PAGE電泳的原理：SDS使蛋白質(zhì)的變性作用，以及此實(shí)驗(yàn)中采用的使不連續(xù)PAGE膠（分離膠和濃縮膠）的原理；

2．SDS－PAGE電泳進(jìn)行純度鑒定的原理：凝膠濃度(T)的選擇與被分離物質(zhì)分子量密切相關(guān)；

3．電泳的操作：制膠、加樣、電泳、撥膠、凝膠染色與脫色；

4．蛋白條帶的觀察以及分子量的估算。

二、實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

1．實(shí)驗(yàn)儀器

SDS-PAGE電泳設(shè)備，電爐，脫色搖床

2. 實(shí)驗(yàn)材料及試劑

實(shí)驗(yàn)材料：蛋清（S1）、粗分離樣品（S2）、離子交換層析中穿透峰下降段樣品（S3）、離子交換層析洗脫峰樣品（S4），橡膠手套

實(shí)驗(yàn)試劑：2×上樣緩沖液、10%SDS、30%丙烯酰胺貯存液、分離膠緩沖液（1.5 mol/LpH8.8 Tris-HCl 緩沖液）、濃縮膠緩沖液（0.5 mol/LpH6.8 Tris-HCl 緩沖液）、10%過(guò)硫酸銨(AP)、TEMED、pH8.3 Tris-Gly電泳緩沖液、1%瓊脂糖溶液、染色液、脫色液

三、實(shí)驗(yàn)步驟

（一）蛋白樣品的處理

取200?L 上述備用蛋白樣品于帶塞的小離心管中，加入200?L 的2×上樣緩沖液，混勻，輕輕蓋上蓋子，封口膜封緊瓶口以免加熱時(shí)迸出，在100℃沸水浴中加熱3～5min，取出后10000r/min 離心10min，取上清待用。

（二）SDS-PADE實(shí)驗(yàn)步驟（適用于大板，若為天能公司的小板，參考附錄中的方法）

1．電泳玻璃板洗凈，并把玻璃板在灌膠支架上固定好。( 試樣格（梳子）臨用前用無(wú)水乙醇擦拭，讓其揮發(fā)至干。)

2．用電泳緩沖液配制1%的瓊脂糖凝膠，煮沸溶解后冷卻至55℃左右，加入制板槽槽內(nèi)封板。（固定玻璃板時(shí)，兩邊用力一定要均勻，防止夾壞玻璃板.）

3．按比例配好分離膠，用移液管快速加入，大約5cm左右，之后加少許蒸餾水，靜置30分鐘。（凝膠配制過(guò)程要迅速, 催化劑TEMED要在注膠前再加入,否則凝結(jié)無(wú)法注膠.注膠過(guò)程最好一次性完成,避免產(chǎn)生氣泡。水封的目的是為了使分離膠上延平直，并排除氣泡。凝膠聚合好的標(biāo)志是膠與水層之間形成清晰的界面。）

4．倒出水并用濾紙把剩余的水分吸干，按比例配好濃縮膠,連續(xù)平穩(wěn)加入濃縮膠至離邊緣5mm處，迅速插入樣梳，靜置25分鐘。（樣梳需一次平穩(wěn)插入,梳口處不得有氣泡,梳底需水平。）

5．拔出樣梳后，在上槽內(nèi)加入緩沖液，沒(méi)過(guò)鋸齒時(shí)可拆去底端的瓊脂糖。（要使鋸齒孔內(nèi)的氣泡全部排出,否則會(huì)影響加樣效果.）

6．加樣5個(gè)，空出第一個(gè)孔，從第二個(gè)開(kāi)始按已編排好的順序依次加入相應(yīng)體積的樣品和蛋白Marker。其中蛋清（S1）和Marker加樣量為2?L，S1、S2、S3、和S4加樣量為10?L。為了練習(xí)和比較上樣量的影響，可以加20?L的S1～S4作為對(duì)照（注射器不可過(guò)低,以防刺破膠體,也不可過(guò)高,在樣下沉?xí)r會(huì)發(fā)生擴(kuò)散。為避免邊緣效應(yīng)，最好選用中部的孔注樣。）

7．電泳槽中加入緩沖液，接通電源，進(jìn)行電泳，開(kāi)始電壓恒定在160V，當(dāng)進(jìn)入分離膠后改為240V，溴酚藍(lán)距凝膠邊緣約5mm時(shí)，停止電泳。

8．凝膠板剝離與染色：電泳結(jié)束后，用專用工具撬開(kāi)短玻璃板，從凝膠板上切下一角作為加樣標(biāo)記，然后放在大培養(yǎng)皿內(nèi)，加入染色液，42℃染色40min左右。（剝膠時(shí)要小心,保持膠完好無(wú)損,染色要充分。）

9．脫色：染色后的凝膠板用蒸餾水漂洗數(shù)次，再用脫色液脫色，直到蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰。

10．將凝膠室溫保存于10％甘油水溶液中，至凝膠掃描分析。

11．凝膠掃描儀掃描并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,求出溶菌/酶的相對(duì)分子質(zhì)量。分析各樣品中溶/菌酶相對(duì)含量的變化。

四、注意事項(xiàng)

1．N,N’-亞甲雙丙烯酰胺為神經(jīng)毒性物質(zhì)，可經(jīng)皮膚直接吸收，使用時(shí)應(yīng)避免其直接接觸皮膚，必要時(shí)應(yīng)戴手套。但其凝固后就變成無(wú)毒物質(zhì)。

2．安裝電泳槽時(shí)要注意均勻用力旋緊固定螺絲，避免緩沖液滲漏。

3．用瓊脂(糖)封底及灌膠時(shí)不能有氣泡，以免電泳時(shí)影響電流的通過(guò)。

4．加樣時(shí)樣品不能超出凹形樣品槽。加樣槽中不能有氣泡，如有氣泡，可用注射器針頭挑除。

五、演示

1．垂直電泳系統(tǒng)的組成及工作原理；

（1）電泳槽：是凝膠電泳系統(tǒng)的核心部分，管式電泳槽、垂直板電泳槽、水平板電泳槽

（2）電源:聚丙烯酰胺凝膠電泳200～600V，載體兩性電解質(zhì)等電聚焦電泳1000～2000V，固相梯度等電聚焦3000～8000V

（3）外循環(huán)恒溫系統(tǒng):高電壓會(huì)產(chǎn)生高熱，需冷卻；

（4）灌膠模具：制膠，玻璃板和梳子；

（5）其他：可以選配電泳轉(zhuǎn)移裝置、電泳洗脫儀、凝膠掃描和攝錄裝置等。

2．制分離膠與濃縮膠。