實(shí)驗(yàn)原理

由于RNA的來(lái)源和種類很多，因而提取制備方法也很各異。一般有苯/酚法、去污劑法和鹽酸胍法。其中苯/酚法又是實(shí)驗(yàn)是最/常用的。組織勻漿用苯/酚處理并離心后，RNA即溶于上層被酚飽和的水相中，DNA和蛋白質(zhì)則留在酚層中。向水層加入乙醇后，RNA即以白色絮狀沉淀析出，此法能較好的除去DNA和蛋白質(zhì)。上述方法提取的RNA具有生物活性。工業(yè)上常用稀堿法和濃鹽法提取RNA，用這兩種方法所提取的核酸均為變性的 RNA，主要用作制備核苷酸的原料，其工藝比較簡(jiǎn)單。濃鹽法使用10%左右氯化鈉溶液，90℃提取3-4h，迅速冷卻，提取液經(jīng)離心后, 上清液用乙醇沉淀RNA。稀堿法使用稀堿使酵母細(xì)胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白質(zhì)和菌體后的上清液用乙醇沉淀RNA或調(diào)pH2.5利用等電點(diǎn)沉淀。

酵母含RNA達(dá)2.67-10.0%，而DNA含量?jī)H為0.03-0.516%，為此，提取RNA多以酵母為原料。

RNA含有核糖、嘌呤堿、嘧啶堿和磷酸各組分。加硫酸煮可使RNA水解，從水解液中可用定糖，定磷和加銀沉淀等方法測(cè)出上述組份的存在。

試劑和器材

一、試劑

0.04M NaOH溶液；95%乙醇；1.5M硫酸；濃氨/水；0.1M硝酸/銀。

酸性乙醇溶液：30mL乙醇加0.3mL HCl。

三氯/化鐵濃鹽溶液：將2mL 10％三氯/化鐵（FeCl3· 6H2O）溶液加入400mL濃HCl。

苔黑酚(3,5-二羥基甲/苯)乙醇溶液：稱取6g苔黑酚溶于95％乙醇100mL。

定磷試劑：

17％硫酸：將17mL濃硫酸（比重1084）緩緩傾入83mL水中；

2.5％鉬酸銨：2.5g鉬酸銨溶于100mL水中；

10％抗壞血酸溶液：10g抗壞血酸溶于100mL 水，棕色并保存溶液；

臨用時(shí)將三種溶液和水按下列比例混合：

17％硫酸：2.5％鉬酸銨：10％抗壞血酸：水＝1：1：1：2（V/V）。

二、材料

干/酵母粉。

三、器材

移液管0.2mL（×1）,2.0mL（×1）, 1mL（×4）; 量筒10 mL（×1）, 50mL（×1）; 滴管；水浴鍋；離心機(jī)。

操作方法

一、酵母RNA提取

稱5g干/酵母粉懸浮于30mL 0.04M NaOH溶液中并在研缽中研磨均勻。懸浮液轉(zhuǎn)入三角燒瓶，沸水浴加熱30min，冷卻，轉(zhuǎn)入離心管。3000轉(zhuǎn)/分，離心15分鐘后，將上清慢慢傾入 10mL酸性乙醇，邊加邊攪動(dòng)。加畢，靜置，待RNA沉淀*后，3000r/min離心3min。棄去上清液。用95％乙醇洗滌沉淀兩次。再用乙mi洗滌沉淀一次后，用乙mi將沉淀轉(zhuǎn)移至布氏漏斗抽濾，沉淀在空氣中干燥。稱量所得RNA粗品的重量，計(jì)算：

二、RNA組份鑒定

取2g提取的核酸，加入1.5M硫酸10mL, 沸水浴加熱10分鐘制成水解液，然后進(jìn)行組份鑒定。

1．嘌呤堿：取水解液1mL 加入過(guò)量濃氨/水。然后加入1mL 0.1M硝酸/銀溶液，觀察有無(wú)嘌呤堿銀化合物沉淀。

2．核糖：取水解液1mL，三氯/化鐵濃鹽酸溶液2mL和苔黑酚乙醇溶液0.2mL。放沸水浴中10min。注意觀察核糖是否變成綠色。

3．磷酸：取水解液1mL，加定磷試劑1mL。在水浴中加熱觀察溶液是否變成藍(lán)色。