養(yǎng)細(xì)胞真的是磨練人性格的一項(xiàng)工作。細(xì)菌真菌支原體各種污染都經(jīng)歷過(guò)了，能把癌癥細(xì)胞養(yǎng)到絕種也是很無(wú)奈。
生活的閱歷就是最大的智慧，所以今天跟大家匯總了細(xì)胞間常用的無(wú)菌技術(shù)操作指南如下:
1、我們要挑選了一個(gè)平時(shí)很少有人用的實(shí)驗(yàn)室作為無(wú)菌室，超凈臺(tái)不能放在靠近門口和窗戶的位置，這個(gè)區(qū)域要保持干凈無(wú)灰塵。為保證超凈臺(tái)工作面的無(wú)菌，使用前需用75%的乙醇擦拭工作面。
2、每天實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)候，超凈臺(tái)/實(shí)驗(yàn)間 照20分鐘紫外是不錯(cuò)的選擇。拿培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)液時(shí)候請(qǐng)托下面拿，切忌不要拿瓶頸部位。
3、工作前和工作后，都要對(duì)超凈臺(tái)進(jìn)行擦拭，特別是有液體溢出的地方。各種盛裝液體的瓶子從冰箱內(nèi)拿出來(lái)后，都要用75%乙醇進(jìn)行擦拭。為確保無(wú)菌操作，最好每次使用之前也要再進(jìn)行擦拭。
4、在操作過(guò)程中，超凈臺(tái)上的所有物品需擺放整齊。整齊的原則是：需要的東西要很容易拿到，拿東西的時(shí)候不能跨越其他物體；超凈臺(tái)內(nèi)的物品不宜過(guò)多，否則會(huì)影響無(wú)菌空氣的層流；實(shí)驗(yàn)完畢后擦拭整個(gè)超凈臺(tái)面，并移走所有物品。
5、對(duì)于我們從試劑公司購(gòu)買的培養(yǎng)基、血清或者其他試劑，一定是經(jīng)過(guò)廠家的質(zhì)量監(jiān)控保證無(wú)菌的，但是盛裝試劑的瓶子外表不是無(wú)菌的。所以在實(shí)際操作中，要在超凈臺(tái)下拆下外包裝，每次使用前需用75%乙醇擦拭。（在這里提出一點(diǎn)疑問(wèn)，有很多人說(shuō)培養(yǎng)基和血清不能照紫外，也有人說(shuō)二者是可以照紫外的，希望有大神幫忙回答一下）
6、從其他實(shí)驗(yàn)室借來(lái)的細(xì)胞，因?yàn)闊o(wú)法保證原來(lái)的實(shí)驗(yàn)室或運(yùn)輸途中是否有污染情況出現(xiàn)，所以首先要在沒(méi)有抗生素的情況下，和本實(shí)驗(yàn)室的細(xì)胞分開(kāi)培養(yǎng)一段時(shí)間，直到證明它們沒(méi)有被污染再放到同一空間。
7、如果不是大批量培養(yǎng)細(xì)胞，我們會(huì)用廣口瓶配制盛裝培養(yǎng)基。廣口瓶*的深螺旋蓋子防污染的效果很好，但是清洗的時(shí)候要特別注意，以防瓶蓋內(nèi)殘留的液體沒(méi)有清洗干凈。
8、培養(yǎng)皿的敞口時(shí)間不易過(guò)長(zhǎng)，不要在敞口的培養(yǎng)皿及培養(yǎng)皿的上方操作。當(dāng)把培養(yǎng)皿從培養(yǎng)箱拿出或放入培養(yǎng)箱中時(shí)，小心不使它們傾斜或受到搖晃，避免培養(yǎng)基進(jìn)入蓋子和皿身的夾縫中。如果不小心出現(xiàn)上述情況，應(yīng)用75 % 乙醇擦掉溢出的培養(yǎng)基，并更換新的蓋子。
9、雖然我們?cè)诓僮鞯倪^(guò)程中會(huì)帶無(wú)菌手套，穿無(wú)菌服，但是個(gè)人衛(wèi)生也是很重要的一點(diǎn)。手部的清潔可以濕潤(rùn)皮膚，洗掉一些微生物，帶走某些皮膚干屑。如果女生是長(zhǎng)頭發(fā)，也要盤頭或馬尾系在身后。如果患有感冒，最好在感冒好之前不要進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)工作，即使帶上口罩，也不能阻擋感冒病毒。
10、玻璃吸管或塑料吸管是轉(zhuǎn)移液體最/方便的途徑。滅菌前，要在玻璃吸管的吸口端加一個(gè)棉塞，這個(gè)塞子能起到防止液體回流造成交叉污染的作用。
11、污染可以從一個(gè)小范圍或一個(gè)培養(yǎng)皿擴(kuò)散到幾個(gè)培養(yǎng)皿，乃至整個(gè)培養(yǎng)箱中。觀察培養(yǎng)皿中細(xì)胞狀態(tài)的時(shí)候，一定要肉眼和顯微鏡雙重仔細(xì)觀察；不能與其他實(shí)驗(yàn)人員公用同一個(gè)瓶子，不同種類的細(xì)胞系哪怕培養(yǎng)基相同，也不能使用同一個(gè)瓶子。
12、在操作過(guò)程中，打開(kāi)和關(guān)上瓶蓋的前后都需要在酒精燈火焰旁灼燒瓶口和瓶蓋。由于空氣對(duì)流的原因，在火焰旁操作，火焰旁的空氣向上走，可以減少附近區(qū)域灰塵下降。
13、超凈臺(tái)之所以會(huì)營(yíng)造出一個(gè)無(wú)菌的環(huán)境，是因?yàn)槔锩嬗谐掷m(xù)穩(wěn)定的過(guò)濾氣流通過(guò)超凈臺(tái)面。水平式超凈臺(tái)的氣流是從實(shí)驗(yàn)人員的對(duì)面吹出，與臺(tái)面平行。垂直式超凈臺(tái)的氣流是從頂部向下吹的臺(tái)面，被吸入后循環(huán)利用。所以對(duì)于垂直式超凈臺(tái)的實(shí)驗(yàn)人員來(lái)說(shuō)，操作時(shí)不要在開(kāi)口的上方操作；而對(duì)于水平式的超凈臺(tái)，實(shí)驗(yàn)人員盡量不要在開(kāi)口的后方操作。
14、水平式超凈臺(tái)可以提供相對(duì)穩(wěn)定的氣流，對(duì)培養(yǎng)物和試劑的無(wú)菌保護(hù)作用較強(qiáng)。但是垂直式給予實(shí)驗(yàn)人員的保護(hù)更多。
15、在操作過(guò)程中，不要把液體從一個(gè)瓶子倒入另一個(gè)瓶子中，因?yàn)檫@種傾倒方式會(huì)將讓液體變成連接瓶?jī)?nèi)外空氣的橋梁。即使瓶子是無(wú)菌容器，這種方式也會(huì)增加污染的風(fēng)險(xiǎn)。
16、水浴鍋很臟，生化培養(yǎng)箱要是得手動(dòng)加濕的話盤里的水也會(huì)很臟，勤換 (滅菌水加進(jìn)去)。
17、操作時(shí)要常更換吸管，切勿一根吸管做到底。一旦發(fā)現(xiàn)吸管口接觸了手和其他污染物品應(yīng)棄去。實(shí)驗(yàn)完畢及時(shí)收拾，保持實(shí)驗(yàn)室清潔整齊，最后用消毒水浸泡的紗布擦臺(tái)面。
18、離開(kāi)過(guò)操作臺(tái)的東西再進(jìn)操作臺(tái)之前一定要用酒精噴一遍，包括一切實(shí)驗(yàn)耗材、儀器、以及你帶著手套的手。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后對(duì)實(shí)驗(yàn)臺(tái)的消毒。紫外什么的，用前用后都照個(gè) 30 分鐘。
19、不管買的細(xì)胞、惠贈(zèng)的細(xì)胞，剛拿到手趕緊做兩件事：檢測(cè)是否有支原體污染； 迅速擴(kuò)增凍存。
20、發(fā)現(xiàn)有污染迅速處理掉，特別是當(dāng)你養(yǎng)了很多種細(xì)胞時(shí)； 細(xì)菌污染，真菌污染很容易發(fā)現(xiàn)，支原體污染的話，細(xì)胞會(huì)長(zhǎng)的慢，買個(gè)支原體檢測(cè)的 kit 定期檢測(cè)一下。
21、細(xì)胞只要是被細(xì)菌污染了，不管用PBS沖洗多少遍，無(wú)論是否用高濃度抗生素處理多久，只要抗生素一撤，污染的細(xì)菌必會(huì)暴發(fā)，唯1能做的就是扔掉這盤細(xì)胞。
22、非常珍貴的腫瘤細(xì)胞被細(xì)菌污染了并且沒(méi)有凍存?zhèn)浞菰趺崔k？可以嘗試小鼠皮下接種，待皮下接種成功后，取下腫瘤消化繼續(xù)培養(yǎng)，小鼠體內(nèi)的免疫系統(tǒng)會(huì)清理掉細(xì)胞中污染的細(xì)菌。
23、如果細(xì)胞反復(fù)污染，記住一定不是操作問(wèn)題，一定是有污染源，請(qǐng)仔細(xì)尋找污染源：培養(yǎng)基、血清、胰/酶、培養(yǎng)瓶…，可以提取上述試劑在新的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，觀察哪一組能培養(yǎng)出細(xì)菌。最/簡(jiǎn)單粗暴但又快捷的方法就是將所有的細(xì)胞培養(yǎng)的試劑和器皿換成新的。
細(xì)胞污染是非常頭疼的一件事情，祝大家細(xì)胞培養(yǎng)順利！
