革蘭氏染色法，是指細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的一種重要的鑒別染色法，屬于復(fù)染法。這種染色法是由丹麥醫(yī)生革蘭于1884年所發(fā)明，最初是用來鑒別肺炎球菌與克雷伯肺炎菌。革蘭染色法一般包括初染、媒染、脫色、復(fù)染等四個(gè)步驟。未經(jīng)染色的細(xì)菌，由于其與周圍環(huán)境折光率差別甚小，故在顯微鏡下極難區(qū)別。經(jīng)染色后，陽性菌呈紫色，陰性菌呈紅色，可以清楚地觀察到細(xì)菌的形態(tài)、排列及某些結(jié)構(gòu)特征，從而用以分類鑒定。染色原理：通過結(jié)晶紫初染和碘液媒染后，在細(xì)菌細(xì)胞壁內(nèi)形成了不溶于水的結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物，再用95%乙醇脫色。

革蘭氏染色液用水：培養(yǎng)基制備用水應(yīng)使用電阻率不小于30萬Ωcm的蒸餾水或與其同質(zhì)的水，不使用離子交換器生產(chǎn)的去離子水。

稱量：稱量時(shí)需用多功能的角匙，預(yù)防交叉污染而影響檢驗(yàn)結(jié)果；干粉培養(yǎng)基易吸潮，如有條件，盡量在濕度較低的房間稱取培養(yǎng)基。

復(fù)水：復(fù)水時(shí)不可用銅鍋或鐵鍋，防止有離子滲入培養(yǎng)基中，影響微生物的生長；容器的大小需大于復(fù)水后培養(yǎng)基總體積的2倍以上，避免在加熱溶解過程中，培養(yǎng)基溢出；含有瓊脂粉的培養(yǎng)基，在加熱溶解之前可以浸泡數(shù)分鐘；加熱培養(yǎng)基時(shí)一定要進(jìn)行攪拌，特別是瓊脂類培養(yǎng)基。

為避免燒焦和沸騰溢出，對(duì)于少量的培養(yǎng)基使用沸水浴進(jìn)行加熱。燒糊的培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)被破壞，并可產(chǎn)生有毒物質(zhì)，如發(fā)現(xiàn)焦化，或未溶解均勻前培養(yǎng)基有溢出，該培養(yǎng)基即不能使用，應(yīng)重新制備。

滅菌：通常培養(yǎng)基采用濕熱滅菌，即高壓蒸汽滅菌，通常是121℃ 15 min，含糖或特殊培養(yǎng)基，按照國家標(biāo)準(zhǔn)或生產(chǎn)商提供的說明滅菌。已配制好的培養(yǎng)基必須立即滅菌，預(yù)防微生物生長繁殖而耗費(fèi)養(yǎng)分，改變培養(yǎng)基的酸堿度。

高溫可破壞培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分，還會(huì)使瓊脂的凝膠強(qiáng)度下降，因此必須嚴(yán)格控制滅菌溫度和時(shí)間，并且不可重復(fù)滅菌。高壓蒸汽滅菌鍋的壓力表等要定期進(jìn)行檢定，并定期采用生物指示菌法或化學(xué)變色紙片對(duì)滅菌效果進(jìn)行驗(yàn)證。

pH測定：細(xì)菌必須在適宜的pH范圍內(nèi)能夠正常生長繁殖或體現(xiàn)其生物特性。培養(yǎng)基配方要求的pH為滅菌或消毒后的pH 值，即培養(yǎng)基使用前的pH，并應(yīng)在25℃溫度下選用精密酸度計(jì)進(jìn)行測量，固體瓊脂培養(yǎng)基應(yīng)以特殊的膠體表面測量電極進(jìn)行測量。應(yīng)用過程中，如果需要調(diào)整培養(yǎng)基的pH，應(yīng)用1mol/L Na0H或 lmol/L HCL調(diào)整，留意不可反復(fù)調(diào)pH，否則會(huì)影響培養(yǎng)基的滲透壓。

配置好的培養(yǎng)基保存：滅菌以后培養(yǎng)基應(yīng)該迅速冷卻至所需溫度，避免長時(shí)間保存在滅菌鍋內(nèi)，導(dǎo)致過度滅菌，影響培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分或選擇性效果。所配制的培養(yǎng)基的量，應(yīng)該是在最長保存期限內(nèi)正好使用完。含染料的培養(yǎng)基應(yīng)閉光保存；倒好的瓊脂平板如果配制的當(dāng)天未使用完，應(yīng)當(dāng)冷藏保存，如果保存時(shí)間超過2天，應(yīng)將其放入密封的塑料袋中保存。