在我們鑒定基因敲除(KO)細(xì)胞是否建立成功時(shí)，除了基因水平的測(cè)序、PCR等方法外，蛋白水平的Western Blot驗(yàn)證也是一個(gè)重要的方法。特別是對(duì)于文章發(fā)表中結(jié)果的呈現(xiàn)，Western Blot圖尤為重要。但在實(shí)際實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中，偶爾也會(huì)出現(xiàn)測(cè)序鑒定為KO純合子但WB實(shí)驗(yàn)卻有條帶的情況，即蛋白殘留。那么基因敲除細(xì)胞時(shí)蛋白殘留是如何產(chǎn)生的呢？
 

　　1 由于目的基因的多轉(zhuǎn)錄本引起的蛋白殘留
 

　　基因一般含有多個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄本，在選擇敲除位點(diǎn)時(shí)，有時(shí)會(huì)很難保證覆蓋所有的轉(zhuǎn)錄本，而未被影響到的轉(zhuǎn)錄本就有可能正常轉(zhuǎn)錄翻譯從而表達(dá)出具有部分功能域的蛋白。因此，我們?cè)谠O(shè)計(jì)KO細(xì)胞方案時(shí)，應(yīng)綜合考慮數(shù)據(jù)庫(kù)基因信息、文獻(xiàn)，甚至通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，從而盡可能地覆蓋多個(gè)轉(zhuǎn)錄本，當(dāng)然，這就對(duì)方案設(shè)計(jì)的人員有較高的技術(shù)和經(jīng)驗(yàn)要求。
 

　　2 由于基因的可變剪切引起的蛋白殘留
 

　　可變剪切指當(dāng)某個(gè)外顯子被破壞或缺失時(shí)，其轉(zhuǎn)錄的mRNA前體通過(guò)不同的剪接方式產(chǎn)生不同的mRNA剪接異構(gòu)體的過(guò)程，是調(diào)節(jié)基因表達(dá)和產(chǎn)生蛋白質(zhì)多樣性的重要機(jī)制。當(dāng)我們構(gòu)建KO細(xì)胞時(shí)，敲除位點(diǎn)處外顯子被切割后，包含在內(nèi)含子中的RNA剪接規(guī)則同時(shí)被破壞，在一定情況下，缺失的外顯子序列在RNA剪切階段被略過(guò)，直接將其上游的外顯子與下游的外顯子相連，形成一種全新的mRNA，從而繼續(xù)蛋白的翻譯。
 

可變剪切發(fā)生機(jī)制
 

　　3 外因——Western Blot抗體的選擇
 

　　Western Blot檢測(cè)技術(shù)是基于抗原抗體的特異性結(jié)合的原理，且抗體并不是識(shí)別整個(gè)目的蛋白，而是識(shí)別某段特定氨基酸序列或其中某部分功能結(jié)構(gòu)域，即抗體的特異性。因此，在采用Western Blot檢測(cè)KO細(xì)胞是否存在蛋白殘留表達(dá)時(shí)，如果選擇的敲除位點(diǎn)相對(duì)靠后，而抗體與蛋白的結(jié)合區(qū)域若存在于敲除位點(diǎn)之前，便可能會(huì)出現(xiàn)抗體與N端殘留蛋白的結(jié)合，從而導(dǎo)致Western Blot檢測(cè)條帶的出現(xiàn)。不過(guò)對(duì)于這種情況，目的蛋白的功能很可能已經(jīng)喪失。
 

　　我們?cè)撊绾我?guī)避蛋白殘留風(fēng)險(xiǎn)？
 

　　首先，也是最重要的，就是gRNA的設(shè)計(jì)！gRNA的設(shè)計(jì)決定了切割位點(diǎn)的位置，因此gRNA的設(shè)計(jì)通常也是避免蛋白殘留問(wèn)題的關(guān)鍵。特別對(duì)于移碼突變的敲除策略，gRNA的設(shè)計(jì)更為重要，一般建議設(shè)計(jì)3條gRNA，并在cell pool階段根據(jù)切割效率的高低來(lái)選擇。
 

　　有g(shù)RNA設(shè)計(jì)經(jīng)驗(yàn)的同學(xué)對(duì)那幾個(gè)常用的gRNA設(shè)計(jì)網(wǎng)站應(yīng)該比較熟悉，但網(wǎng)站設(shè)計(jì)的結(jié)果只是一個(gè)參考，我們不僅需要綜合多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的設(shè)計(jì)結(jié)果、也要結(jié)合相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道，同時(shí)參考常用抗體信息的分析，并根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行階段性的WB測(cè)試，從而實(shí)現(xiàn)所建立的KO細(xì)胞無(wú)蛋白殘留。
 

　　另外，對(duì)于長(zhǎng)度較短、又無(wú)法找到合適切割位點(diǎn)的基因，我們也可采取大片段敲除或全敲的策略，確保得到的純合子細(xì)胞蛋白不殘留。