近年來隨著儀器和試劑的不斷發(fā)展，幾乎所有的免疫檢測應(yīng)用都可以獲得熒光讀數(shù)。不過，盡管免疫熒光技術(shù)能夠提供靈敏而準(zhǔn)確的結(jié)果，并適合多重檢測，但優(yōu)化還是bi不可少的。
 

       操作方案要優(yōu)化

 

　　免疫熒光染色的操作方案通常包括：固定和透化、封閉、一抗孵育、洗滌、二抗孵育、再次洗滌以及測定讀數(shù)。大多數(shù)研究人員的染色方案都是一成不變的，因此建議在使用珍貴的樣本材料時，花點(diǎn)時間優(yōu)化操作方案的每一步。
 

　　就一抗孵育而言，必須考慮抗體的建議稀釋度，以實(shí)現(xiàn)高的信背比。若抗體濃度過低，則熒光信號較弱，可能難以與背景區(qū)分開，但抗體濃度過高，則會導(dǎo)致較高的背景染色。千萬不要低估各步驟之間*洗滌的重要性。利用生理溶液來洗滌，可去除未結(jié)合的熒光試劑，或那些只是粘在目標(biāo)上而非特異性結(jié)合的熒光試劑，從而提高信背比。
 

　　熒光試劑要放好
 

　　盡管許多熒光基團(tuán)具有相對的光穩(wěn)定性，但在保存和染色過程中若未能避光，則可能導(dǎo)致熒光基團(tuán)-抗體結(jié)合物降解，引起假陰性結(jié)果。熒光物質(zhì)必須在建議溫度下小心保存，并始終注意避光，以保護(hù)其光譜完整性。特別指出，串聯(lián)的熒光基團(tuán)對頻繁操作引起的不穩(wěn)定性特別敏感。
 

　　盡管免疫熒光技術(shù)提供了準(zhǔn)確的結(jié)果，但也存在一些缺點(diǎn)，包括自發(fā)熒光、熒光信號的淬滅，以及標(biāo)本存儲過程中的信號褪色。按照建議的實(shí)驗(yàn)方案來操作，研究人員可以避免一些技術(shù)上的缺陷。
 

　　選擇熒光要謹(jǐn)慎
 

　　免疫熒光技術(shù)的一個主要優(yōu)勢在于它為多重檢測提供了機(jī)會，如今流式細(xì)胞儀能檢測每個細(xì)胞中20多個離散參數(shù)。在設(shè)計(jì)多重實(shí)驗(yàn)時，應(yīng)考慮每種熒光基團(tuán)的*性質(zhì)，如最大吸收波長和最大發(fā)射波長，消光系數(shù)和斯托克斯位移等因素。人們通常要檢測組織或細(xì)胞樣本中的多個抗原，必須選擇光譜不重疊的熒光基團(tuán)。即使是最hao的檢測系統(tǒng)，也無法克服儀器和試劑之間的不匹配。
 

　　合適對照不可少
 

　　任何實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析都依賴于相關(guān)的對照，免疫熒光染色也不例外。不加一抗，則能說明觀察到的信號是否來源于二抗與組織或細(xì)胞樣本的非特異性結(jié)合，此外，建議使用不表達(dá)目標(biāo)的細(xì)胞或組織作為陰性對照。同時，為了確保所有組分都正常發(fā)揮作用，那些已知表達(dá)目標(biāo)的陽性對照也少不了。在熒光Western blot或ELISA技術(shù)中，含有目標(biāo)抗原的蛋白或肽段適合作為陽性對照。
 

　　總之，免疫熒光染色是一種流行且強(qiáng)大的檢測方法。通過精心選擇熒光基團(tuán)，并開發(fā)可靠的染色方案，你可以生成豐富的數(shù)據(jù)。