重組蛋白表達(dá)技術(shù)現(xiàn)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物學(xué)各個(gè)具體領(lǐng)域。特別是體內(nèi)功能研究和蛋白質(zhì)的大規(guī)模生產(chǎn)都需要應(yīng)用重組蛋白表達(dá)載體。本文將簡(jiǎn)要介紹幾個(gè)常用載體標(biāo)簽及其功能和優(yōu)點(diǎn)。
一. GST標(biāo)簽
GST(谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶) 標(biāo)簽蛋白本身是一個(gè)在解毒過(guò)程中起到重要作用的轉(zhuǎn)移酶，它的天然大小為26KD。將它應(yīng)用在原核表達(dá)的原因大致有兩個(gè)，一是因?yàn)樗且粋€(gè)高度可溶的蛋白，希望可以利用它增加外源蛋白的可溶性；另一個(gè)是它可以在大腸桿菌中大量表達(dá)，起到提高表達(dá)量的作用。
GST融合表達(dá)系統(tǒng)廣泛應(yīng)用于各種融合蛋白的表達(dá)，可以在大腸桿菌和酵母菌等宿主細(xì)胞中表達(dá)。結(jié)合的融合蛋白在非變性條件下用10mM 還原型谷胱甘肽洗脫。
在大多數(shù)情況下，融合蛋白在水溶液中是可溶的，并形成二體。GST標(biāo)簽可用酶學(xué)分析或免疫分析很方便的檢測(cè)。標(biāo)簽有助于保護(hù)重組蛋白免受胞外蛋白酶的降解并提高其穩(wěn)定性。在大多數(shù)情況下GST融合蛋白是*或部分可溶的。
純化：該表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的GST標(biāo)簽蛋白可直接從細(xì)菌裂解液中利用含有還原型谷胱甘肽瓊脂糖凝膠(Glutathionesepharose)親和樹(shù)脂進(jìn)行純化。GST標(biāo)簽蛋白可在溫和、非變性條件下洗脫，因此保留了蛋白的抗原性和生物活性。GST在變性條件下會(huì)失去對(duì)谷胱甘肽樹(shù)脂的結(jié)合能力，因此不能在純化緩沖液中加入強(qiáng)變性劑如：鹽酸胍或尿素等。
如果要去除GST融合部分，可用位點(diǎn)特異性蛋白酶切除。
檢測(cè)：可用GST抗體或表達(dá)的目的蛋白特異性抗體檢測(cè)。
二.His6標(biāo)簽
His6是指六個(gè)組氨酸殘基組成的融合標(biāo)簽，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。當(dāng)某一個(gè)標(biāo)簽的使用，一是能構(gòu)成表位利于純化和檢測(cè)；二是構(gòu)成*的結(jié)構(gòu)特征（結(jié)合配體）利于純化。組氨酸殘基側(cè)鏈與固態(tài)的鎳有強(qiáng)烈的吸引力，可用于固定化金屬螯合層析(IMAC)，對(duì)重組蛋白進(jìn)行分離純化。
使用His-tag的優(yōu)點(diǎn)
1.標(biāo)簽的分子量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分別為~26KD和~30KD，一般不影響目標(biāo)蛋白的功能；
2.His標(biāo)簽融合蛋白可以在非離子型表面活性劑存在的條件下或變性條件下純化，前者在純化疏水性強(qiáng)的蛋白得到應(yīng)用，后者在純化包涵體蛋白時(shí)特別有用，用高濃度的變性劑溶解后通過(guò)金屬螯和親和層析去除雜蛋白，使復(fù)性不受其它蛋白的干擾，或進(jìn)行金屬螯和親和層析復(fù)性；
3.His標(biāo)簽融合蛋白也被用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-DNA相互作用研究；
4.His標(biāo)簽免疫原性相對(duì)較低，可將純化的蛋白直接注射動(dòng)物進(jìn)行免疫制備抗體；
5.可應(yīng)用于多種表達(dá)系統(tǒng)，純化的條件溫和；
6.可以和其它的親和標(biāo)簽一起構(gòu)建雙親和標(biāo)簽。
三.MBP標(biāo)簽
MBP（麥芽糖結(jié)合蛋白）標(biāo)簽蛋白大小為40kDa，由大腸桿菌K12的malE基因編碼。MBP可增加在細(xì)菌中過(guò)量表達(dá)的融合蛋白的溶解性，尤其是真核蛋白。MBP標(biāo)簽可通過(guò)免疫分析很方便地檢測(cè)。有必要用位點(diǎn)專一的蛋白酶切割標(biāo)簽。如果蛋白在細(xì)菌中表達(dá)，MBP可以融合在蛋白的N端或C端。
純化：融合蛋白可通過(guò)交聯(lián)淀粉親和層析一步純化。結(jié)合的融合蛋白可用10mM麥芽糖在生理緩沖液中進(jìn)行洗脫。結(jié)合親和力在微摩爾范圍。一些融合蛋白在0.2% Triton X-100或0.25% Tween 20存在下不能有效結(jié)合，而其他融合蛋白則不受影響。 緩沖條件為pH7.0到8.5，鹽濃度可高達(dá)1M，但不能使用變性劑。如果要去除MBP融合部分，可用位點(diǎn)特異性蛋白酶切除。
檢測(cè)：可用MBP抗體或表達(dá)的目的蛋白特異性抗體檢測(cè)。
四. Flag標(biāo)簽
Flag標(biāo)簽蛋白為編碼8個(gè)氨基酸的親水性多肽（DYKDDDDK），同時(shí)載體中構(gòu)建的Kozak序列使得帶有FLAG的融合蛋白在真核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)效率更高。
使用Flag標(biāo)簽的優(yōu)點(diǎn)
FLAG作為標(biāo)簽蛋白，其融合表達(dá)目的蛋白后具有以下優(yōu)點(diǎn)：
1.FLAG作為融合表達(dá)標(biāo)簽，其通常不會(huì)與目的蛋白相互作用并且通常不會(huì)影響目的蛋白的功能、性質(zhì)，這樣就有利用研究人員對(duì)融合蛋白進(jìn)行下游研究。
2.融合FLAG的目的蛋白，可以直接通過(guò)FLAG進(jìn)行親和層析，此層析為非變性純化，可以純化有活性的融合蛋白，并且純化效率高。
3.FLAG作為標(biāo)簽蛋白，其可以被抗FLAG的抗體識(shí)別，這樣就方便通過(guò)Western Blot、ELISA等方法對(duì)含有FLAG的融合蛋白進(jìn)行檢測(cè)、鑒定。
4.融合在N端的FLAG，其可以被腸激酶切除（DDDK），從而得到特異的目的蛋白。因此現(xiàn)FLAG標(biāo)簽已廣泛的應(yīng)用于蛋白表達(dá)、純化、鑒定、功能研究及其蛋白相互作用等相關(guān)領(lǐng)域。
五.SUMO標(biāo)簽
SUMO標(biāo)簽蛋白是一種小分子泛素樣修飾蛋白（Small ubiquitin-likemodifier），是泛素(ubiquitin)類多肽鏈超家族的重要成員之一。
在一級(jí)結(jié)構(gòu)上，SUMO與泛素只有18%的同源性，然而兩者的三級(jí)結(jié)構(gòu)及其生物學(xué)功能卻十分相似。研究發(fā)現(xiàn)SUMO可以作為重組蛋白表達(dá)的融合標(biāo)簽和分子伴侶，不但可以進(jìn)一步提高融合蛋白的表達(dá)量，且具有抗蛋白酶水解以及促進(jìn)靶蛋白正確折疊，提高重組蛋白可溶性等功能。
此外SUMO還有一項(xiàng)重要的應(yīng)用，就是可用于完整地切除標(biāo)簽蛋白，得到天然蛋白。因?yàn)镾UMO蛋白水解酶能識(shí)別完整的SUMO標(biāo)簽蛋白序列，并能高效地把SUMO從融合蛋白上切割下來(lái)。切除SUMO后，經(jīng)過(guò)親和層析，去除標(biāo)簽蛋白部分，就得到和天然蛋白一樣的重組蛋白。所以SUMO標(biāo)簽也常用于和其他標(biāo)簽一起應(yīng)用，作為特異酶切水解位點(diǎn)。
六.HA標(biāo)簽
HA標(biāo)簽蛋白，標(biāo)簽序列YPYDVPDYA，源于流感病毒的紅細(xì)胞凝集素表面抗原決定簇，9個(gè)氨基酸，對(duì)外源靶蛋白的空間結(jié)構(gòu)影響小, 容易構(gòu)建成標(biāo)簽蛋白融合到N端或者C端。易于用Anti－HA抗體檢測(cè)和ELISA檢測(cè)。
七.c-Myc標(biāo)簽
C-Myc標(biāo)簽蛋白，是一個(gè)含11個(gè)氨基酸的小標(biāo)簽，標(biāo)簽序列Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu，這11個(gè)氨基酸作為抗原表位表達(dá)在不同的蛋白質(zhì)框架中仍可識(shí)別其相應(yīng)抗體。C-Myc tag已成功應(yīng)用在 Western-blot雜交技術(shù)、免疫沉淀和流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)中, 可用于檢測(cè)重組蛋白質(zhì)在靶細(xì)胞中的表達(dá)。
八.eGFP/eCFP/eYFP/mCherry
分別是增強(qiáng)型綠色熒光蛋白/增強(qiáng)型黃綠色熒光蛋白/增強(qiáng)型黃綠色熒光蛋白/單體紅色熒光蛋白,具有不同的激發(fā)波長(zhǎng)發(fā)射波長(zhǎng)為，均由野生型熒光蛋白通過(guò)氨基酸突變和密碼子優(yōu)化而來(lái)。
就eGFP而言，相對(duì)于GFP，其熒光強(qiáng)度更強(qiáng)、熒光性質(zhì)更穩(wěn)定。同時(shí)載體中構(gòu)建的Kozak序列使得含有eGFP的融合蛋白在真核表達(dá)
