[原理]
由于蛋白質(zhì)中存在著含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，因此蛋白質(zhì)溶液在280nm處具有紫外吸收高峰。在一定濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液在此波長(zhǎng)處的吸光度與其濃度呈正比關(guān)系，因此利用這一性質(zhì)可進(jìn)行蛋白質(zhì)定量測(cè)定。
該法迅速、簡(jiǎn)便、不消耗樣品、低濃度鹽類不干擾測(cè)定，可測(cè)定0.1～1.0mg/mL的蛋白質(zhì)溶液。
由于蛋白質(zhì)的紫外吸收高峰常因pH變化而改變，故應(yīng)用此法時(shí)要注意溶液的pH。最好樣品的pH與標(biāo)準(zhǔn)曲線制定時(shí)的pH一致。
本法對(duì)于測(cè)定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異較大的蛋白質(zhì)誤差較大，故適用于測(cè)定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)酪氨酸、色氨酸這類氨基酸含量相仿的樣品；若樣品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物質(zhì)，會(huì)出現(xiàn)較大干擾。
例如混有核酸，核酸可吸收波長(zhǎng)為280nm的紫外光，但它對(duì)260nm紫外光吸收更強(qiáng)。而蛋白質(zhì)恰恰相反，280nm的紫外吸收值大于260nm紫外吸收值。運(yùn)用280/260吸收差法則可以適當(dāng)校正核酸對(duì)蛋白質(zhì)濃度測(cè)定的干擾作用。
[方法與步驟]
1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
取7支試管，編號(hào)后按下表依次加入標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液和氫氧化鈉溶液。
管號(hào) 試劑 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液/mL | 0 | 0.5 | 1.0 | 1.5 | 2.0 | 2.5 | 3.0 |
0.1mol/L NaOH/mL | 4.0 | 3.5 | 3.0 | 2.5 | 2.0 | 1.5 | 1.0 |
加畢，攪勻，選用石英比色皿，用紫外 分光光度計(jì) 測(cè)A280。
以每管標(biāo)準(zhǔn)蛋白毫克數(shù)為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的A280值為縱坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
2、蛋白樣品測(cè)定
（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線法
實(shí)驗(yàn)中樣品可用牛奶中自制的酪蛋白溶液加0.1mol/L NaOH稀釋而成。
把樣品蛋白溶液裝入石英 比色皿 中，測(cè)A280，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線求得蛋白質(zhì)濃度。
式中 n——從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出的酪蛋白毫克數(shù)。
（2）280nm與260nm吸收差法：
分別測(cè)定蛋白質(zhì)樣品在280nm、260nm處的吸收值，按下列公式計(jì)算蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。
蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度（mg/ mL）=1.45 A280 - 0.74 A260式中 A280——蛋白質(zhì)溶液在280nm出測(cè)得的吸光度；A260——蛋白質(zhì)溶液在260nm出測(cè)得的吸光度。不同蛋白質(zhì)及核酸的光吸收率不*相同，按此式計(jì)算仍可能產(chǎn)生誤差。
