1.實(shí)驗(yàn)安排
實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備；
采樣、恒溫培養(yǎng)富集及初篩；
觀察產(chǎn)氣情況及稀釋、倒培養(yǎng)基、劃線、涂布、倒置培養(yǎng)；
鑒定、接種；
菌種保藏。

2.具體操作步驟實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
①配置培養(yǎng)基(伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基：7.4g+200mL無菌水、調(diào)pH7.2～7.4，營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：6.6g+200mL無菌水、調(diào)pH7.4±0.2,0.85%生理鹽水、乳糖膽鹽液體培養(yǎng)基2.6g+100mL無菌水，調(diào)pH7.4±0.2),裝瓶，高壓蒸汽滅菌。
②包扎好培養(yǎng)皿，移液管，試管，進(jìn)行干熱滅菌。
③將配好的乳糖膽鹽液體培養(yǎng)基分裝入三個(gè)試管中，每個(gè)大約十毫升，包扎，滅菌。
④液體石蠟和涂布棒等其他實(shí)驗(yàn)玻璃器進(jìn)行滅菌。
采樣、培養(yǎng)
取水，湖水，廢水三樣約2～3滴于3支已滅菌的乳糖膽鹽液體培養(yǎng)基試管中，貼好標(biāo)簽（采樣時(shí)間、人物、溫度，采樣地點(diǎn)及天氣情況），塞好棉塞，于恒溫箱（37℃）培養(yǎng)18～24小時(shí)；

觀察產(chǎn)氣情況、稀釋
①觀察產(chǎn)氣管有無氣柱，標(biāo)記陽性管數(shù)。
②樣品稀釋：
對已滅菌的5只試管編號（分別為1、2、3、4、5號），從樣液試管取1mL樣品液放入盛有9mL生理鹽水的試管中為1號試管，換一只移液管，按上述方法依次配置5份10倍系列稀釋液。貼明標(biāo)簽。

劃線、涂布
①涂布平板法：
將已熔化的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基倒入無菌平皿，制成無菌平板，冷卻凝固后，將一定量的含大腸菌群的污水滴加在平板表面，再用無菌玻璃涂棒將菌液均勻分散至整個(gè)平板表面，置培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24小時(shí)。經(jīng)培養(yǎng)后挑取單個(gè)菌落。

涂布平板法操作：
1.取少量菌液（不超過0.1ml），滴加到培養(yǎng)基表面；
2.用滅菌過的涂布棒或一次性涂布棒將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。涂布時(shí)可轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿，使涂布均勻。
注意：1.將涂布器末端浸在盛有體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精的燒杯中。取出時(shí)，要讓多余的酒精在燒杯中滴盡，然后將沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃。
2.操作中一定要注意防火！不要將過熱的涂布器放在盛放酒精的燒杯中，以免引燃其中的酒精。）

②平板劃線法：
經(jīng)培養(yǎng)后挑取單個(gè)菌落，接種環(huán)以無菌操作沾取少許菌落，在無菌伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基平板表面進(jìn)行連續(xù)劃線，微生物細(xì)胞數(shù)量將隨著劃線次數(shù)的增加而減少，并逐步分散開來，如果劃線適宜的話，微生物能一一分散。在37℃經(jīng)培養(yǎng)24小時(shí)后，可在平板表面得到單菌落。（有時(shí)這種單菌落并非都由單個(gè)細(xì)胞繁殖而來的，故必須反復(fù)分離多次才可得到純種。）

鑒定
觀察EMB平板，菌落呈紫黑色，具有或略有金屬光澤，或者呈淡紫紅色，僅中心顏色較深，選取符合上述特征的單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢（油鏡）觀察是否為無芽孢的革蘭氏陰性短桿菌。

培養(yǎng)
a.將菌落轉(zhuǎn)入裝有玻璃珠的滅菌錐形瓶中調(diào)節(jié)酸堿度為7，充分搖勻備用。
b.液體發(fā)酵：取處理好的樣品液1mL加入滅菌的乳糖膽鹽液體培養(yǎng)基中。搖勻后置培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24小時(shí)