實驗方法原理：

二倍體細(xì)胞來源體內(nèi)二倍體細(xì)胞，也即正常細(xì)胞的初代培養(yǎng)。初代培養(yǎng)細(xì)胞成功后能始終保持二倍體細(xì)胞性狀，便成為二倍體細(xì)胞培養(yǎng)。

二倍體細(xì)胞雖不難培養(yǎng)，但欲求長期呈旺盛地增殖生長、并保持二倍體細(xì)胞性狀，亦非易事。為此必須采取一些有效的措施，一是低溫凍存，二是妥善的培養(yǎng)方法。

用反復(fù)傳代的方法以求獲得大量細(xì)胞和維持細(xì)胞長期生存的辦法是不妥的。因在反復(fù)傳代中，難免由于培養(yǎng)條件的變化和其它不利影響，使細(xì)胞生物學(xué)性狀發(fā)生變化。隨時間延長不僅能導(dǎo)致細(xì)胞停止生長，并可失掉二倍體性狀或發(fā)生轉(zhuǎn)化。

實驗材料：細(xì)胞

試劑、試劑盒：培養(yǎng)液 BSS 胰蛋白酶 消化液

儀器、耗材：培養(yǎng)瓶

實驗步驟：

二倍體細(xì)胞培養(yǎng)方法與一般培養(yǎng)相同，關(guān)鍵在于傳代，其傳代程序為

1.  吸除舊培養(yǎng)液注入另瓶中；

2.  用BSS沖洗1 次；

3.  用0.25%胰蛋白酶消化，加入消化液量以僅覆蓋住細(xì)胞層即可；作用1~5 分鐘；

4.  待細(xì)胞附著松動、細(xì)胞質(zhì)邊緣卷起和間隔加大，便終止消化；為防止細(xì)胞丟失可不必再用BSS沖洗，直接向瓶中加入培養(yǎng)液（新舊培養(yǎng)液按2：1）新舊混合；

5.  輕輕反復(fù)吹打制成單個細(xì)胞懸液（消化不足或吹打不充分，易形成細(xì)胞團(tuán)，不利于生長，應(yīng)注意避免）；

6.  按一分為二比例接種培養(yǎng)。

其他：

1.  采取以下措施可能利于二倍體細(xì)胞培養(yǎng)

（1）嚴(yán)格控制pH值，在5 %CO2溫箱中培養(yǎng)；

（2）換液時間不要間隔太長，且不要全部geng新，盡量保留一部分舊培養(yǎng)液，以棄掉1/2或2/3為妥；

（3）傳代期不能過長，不能讓細(xì)胞長得過于密集，一旦細(xì)胞接近或剛剛連接成片，即進(jìn)行傳代；

（4）要選用高質(zhì)量的培養(yǎng)基和血清，并盡量維持不變，每次傳代都按一分為二的原則（細(xì)胞數(shù)量、營養(yǎng)液量、培養(yǎng)瓶的空間和面積都不得一樣）進(jìn)行培養(yǎng)；

（5）傳代后如細(xì)胞不用于實驗，立即低溫凍存。

2.  來源于胚胎的二倍體成纖維細(xì)胞平均分裂 50 次左右即進(jìn)入衰退期。

不同種類和來源的二倍體細(xì)胞生存期都不一樣，但生存期皆有限。

雖然二倍體細(xì)胞具有限的生存期，卻*能滿足反復(fù)使用的要求。

以成纖維細(xì)胞為例，即便從初代接種1 個細(xì)胞算起，按產(chǎn)生的細(xì)胞數(shù)=n×2n（n=接種細(xì)胞數(shù)）計算，它所提供的細(xì)胞也近天文數(shù)字。而在實際應(yīng)用上，初代接種的細(xì)胞都幾十萬以上，因此一個二倍體細(xì)胞系zui終提供的細(xì)胞數(shù)量近于無限的。