在實(shí)驗(yàn)室中，尤其是分子生物類的實(shí)驗(yàn)室中不可避免的會(huì)遇到細(xì)胞總RNA提取實(shí)驗(yàn)，所提RNA樣品的質(zhì)量和純度直接影響下一步的實(shí)驗(yàn)，如逆轉(zhuǎn)錄，RT-PCR, microarray 等。下面我們來(lái)介紹如何提取細(xì)胞中的總RNA 。
首先，我們要知道什么是總RNA?？俁NA包括mRNA和miRNA等，其中mRNA也就是信使RNA，是具有編碼蛋白質(zhì)的功能的長(zhǎng)RNA，傳遞遺傳信息。miRNA是小型非編碼RNA，長(zhǎng)度約22個(gè)堿基，可以調(diào)控或沉默基因表達(dá)。我們的目的是得到質(zhì)量好，純度高，完整的RNA樣品。操作如下：
細(xì)胞裂解 細(xì)胞的獲取方式不同，采用的裂解方法也不盡相同。 1）若是組織中提取，按照每50-100mg樣品加入1mlTrizol的比例加入Trizol，而后勻漿破碎樣品。細(xì)胞破碎后在室溫下靜置5分鐘，這樣可以分離出核蛋白復(fù)合物（nucleoprotein complexes），然后離心去除細(xì)胞碎片。 2）若是培養(yǎng)瓶中貼壁細(xì)胞，則先用冰PBS洗2次，而后按每10平方厘米區(qū)域加入1ml Trizol的比例加入Trizol, 吹打混勻處理。 3）若是懸浮細(xì)胞，離心收集細(xì)胞，去除培養(yǎng)基，然后加入適量Trizol吹打混勻處理。
可以發(fā)現(xiàn)這步操作主要用到了Trizol這個(gè)試劑。那么Trizol的作用是什么呢？Trizol的主要成分是苯酚，是有效的蛋白變性劑。它能夠抑制酶活性包括RNAaes，這樣可以保證RNA不會(huì)被降解掉，同時(shí)Trizol能夠使細(xì)胞裂解。
抽提RNA 向EP管中的細(xì)胞液加入200ul氯-仿，渦旋15秒后，室溫靜置3分鐘，然后4℃，12000rpm,15min條件下離心。離心后分3層，上層為無(wú)色或淡粉色含有RNA，中層為白色蛋白質(zhì)層，下層為紅色含有脂質(zhì)和培養(yǎng)基。我們所需的RNA就在氯-仿的作用在分在上層的水相中。
氯-仿是有機(jī)溶劑，添加氯-仿會(huì)使細(xì)胞內(nèi)的蛋白變性沉淀，可以通過(guò)離心進(jìn)行去除。同時(shí)加入氯-仿后，水相和有機(jī)相會(huì)分層，將水相中的酚抽提以免損傷核酸，另外還能溶解一些脂溶性雜質(zhì)純化RNA。
沉淀RNA 吸取上層水相于新的EP管中，不要吸取中間蛋白質(zhì)層，加入等體積的異丙醇，一般是500ul上清和500ul異丙醇，少的時(shí)候可以取200ul的上清。兩者充分混勻，室溫放置10分鐘,然后4℃，12000rpm離心10分鐘。離心結(jié)束后，棄去上清，管底可見(jiàn)白色膠狀沉淀，這就是我們的RNA了。
好奇心強(qiáng)的朋友一定會(huì)問(wèn)了，加入異丙醇的作用是什么呢？異丙醇的作用就是沉淀水相中的RNA并抑制RNA酶活性，其羥基的疏水作用能保護(hù)RNA中的親水基團(tuán)。
洗滌RNA 為了進(jìn)行RNA的洗滌，我們需要用DEPC水配制75%的乙醇溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。哪尼？你不知道什么是DEPC水。DEPC水呢，就是是用DEPC(diethyl pyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)處理過(guò)并經(jīng)高溫高壓滅菌的MiliQ純水，里面不含雜質(zhì)RNA，DNA和蛋白質(zhì)。
按照添加的Trizon的量1:1體積配乙醇溶液，一般是750ul分析純乙醇加上250ul DEPC水，在渦旋儀上使乙醇溶液與RNA充分混勻，4℃，9000rpm,5min離心。然后小心棄去上清，不要吸走管底的RNA哦。
再次洗滌RNA 重復(fù)第四步驟，再次洗滌RNA，棄去上清后，控干EP管。，室溫下將EP管倒置在吸水紙上5-10min,酌情加入20-50ul DEPC水溶解RNA，這就是我們終提取到的RNA了。
測(cè)定RNA純度和濃度 用微量紫外分光光度計(jì)取1-2ul RNA檢測(cè)即可。A260/A280值在1.8-2.0間符合純度。RNA在260nm處有大吸收，A260=1.0代表RNA的濃度為40ug/ml。A280用于檢測(cè)蛋白污染，純RNA樣品的A260/A280=2.1，一般所得比值在1.8-2.0間也是普遍認(rèn)可的。另外，我們也可以測(cè)定A230。A230用于檢測(cè)其他污染，主要來(lái)自RNA提取試劑，理想的A230值要大于1.5。另外RNA的完整性可以用1%的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。
操作注意事項(xiàng)： 1. 在收集細(xì)胞時(shí)，離心操作過(guò)程中離心管中看不見(jiàn)明顯的細(xì)胞沉淀時(shí)，可以在倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)瓶細(xì)胞殘留，判斷細(xì)胞是否都消化下來(lái)。另外，可以適當(dāng)延長(zhǎng)離心時(shí)間。
2.加入氯-仿時(shí)，要?jiǎng)×一靹蚴箖上?混勻 。DNA在水飽和酚的酸性條件下是會(huì)被留在有機(jī)相的，不會(huì)跑水相里頭去。吸取上清液時(shí)盡量不要分到不同的新的EP管中，本身量不多時(shí)，盡量集中到一個(gè)管中，同時(shí)也避免吸到中間蛋白降低純度。
3.加入異丙醇后沒(méi)有看到明顯的乳白色沉淀時(shí)，可以在-20℃過(guò)夜再離心，也可以繼續(xù)按照實(shí)驗(yàn)操作往下做。
每個(gè)實(shí)驗(yàn)室的提取方法可能不盡相同，此處的方法僅供參考交流。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中遵守操作規(guī)范，嚴(yán)謹(jǐn)實(shí)驗(yàn)，這樣便能大大提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。
