原代細(xì)胞的培養(yǎng)步驟

一、靜置貼壁細(xì)胞(包括半貼壁細(xì)胞的培養(yǎng))培養(yǎng)要求

1、細(xì)胞要通過充分漂洗，以盡量除去消化液的毒性；

2、細(xì)胞接種時(shí)濃度要稍大一些，至少為5×108細(xì)胞/L；

3、培養(yǎng)基可用Eagle(MEM)或DNEM培養(yǎng)；

4、小牛血清濃度為10%-80%；

5、應(yīng)在37℃5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

6、在起始的2天中盡量減少振蕩，以防止剛貼壁的細(xì)胞發(fā)生脫落，漂浮；

7、待細(xì)胞基本貼壁伸展并逐漸形成網(wǎng)狀，應(yīng)將原代細(xì)胞換液；

8、用骨髓或外周血中的懸浮細(xì)胞經(jīng)靜置培養(yǎng)1周時(shí)，應(yīng)將細(xì)胞懸液經(jīng)低速離心后換液。

二、懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)要求

1、原代培養(yǎng)時(shí)要盡量去除紅細(xì)胞；

2、短期培養(yǎng)，可在含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中進(jìn)行；

3、細(xì)胞濃度可在5-8×109/L范圍內(nèi)進(jìn)行分瓶試驗(yàn)；

4、長期培養(yǎng)時(shí)，淋巴細(xì)胞中要加入生長因子，白血病細(xì)胞中要加入少量的原患者血清，以利細(xì)胞生長；

5、細(xì)胞換液一般每隔3天需半量換液一次；

6、細(xì)胞傳代一般待細(xì)胞增殖加快、細(xì)胞密度較高時(shí)才能進(jìn)行。

三、原代細(xì)胞的維持

1、貼壁細(xì)胞長成網(wǎng)狀或基本單層時(shí)，未達(dá)到飽和密度，需采取換液方式來更新營養(yǎng)成分以滿足細(xì)胞繼續(xù)生長繁殖的需要；

2、換入等量*培養(yǎng)基或換成含2%小牛血清的維持液；

3、懸浮細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)基中不僅會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)化而且會(huì)發(fā)生分裂繁殖，此時(shí)培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分并不能維持細(xì)胞的營養(yǎng)需求，需進(jìn)行換液。通常采用半量換液的方法；

四、原代細(xì)胞培養(yǎng)的*傳代

原代培養(yǎng)后由于懸浮細(xì)胞增殖，數(shù)量增加甚至達(dá)飽和密度；貼壁細(xì)胞的相互匯合，使整個(gè)瓶底逐漸被細(xì)胞覆蓋，細(xì)胞難以繼續(xù)生長繁殖，需要進(jìn)行分瓶培養(yǎng)，這種使原代細(xì)胞經(jīng)分散接種的過程稱之為傳代。

*傳代應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：

(1)細(xì)胞生長密度不高時(shí)，不能急于傳代。

(2)原代培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞需控制消化時(shí)間。

(3)吹打已消化的細(xì)胞應(yīng)減少機(jī)械損傷。

(4)*傳代時(shí)細(xì)胞接種數(shù)量要多一些。

(5)*傳代培養(yǎng)的pH應(yīng)偏低些。小牛血清濃度可加大至15%～20%左右。

五、其他培養(yǎng)法

（一）組織塊培養(yǎng)法

組織塊培養(yǎng)是常用、簡便易行和成功率較高的原代培養(yǎng)方法。其基本方法是將剪成的小組織團(tuán)塊接種于培養(yǎng)瓶（或皿）中，瓶壁可預(yù)先涂以膠原薄層，以利于組織塊粘著于瓶壁，使周邊細(xì)胞能沿瓶壁向外生長。

（二）懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法

對(duì)于懸浮生長的細(xì)胞，如白血病細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、胸水和腹水中的癌細(xì)胞和免疫細(xì)胞無需消化，可采用低速離心分離，直接培養(yǎng)，或經(jīng)淋巴細(xì)胞分層液分離后接種培養(yǎng)。

（三）器官培養(yǎng)

器官培養(yǎng)是指從供體取得器官或組織塊后，不進(jìn)行組織分離而直接在體外的特定環(huán)境條件下培養(yǎng)，器官培養(yǎng)可保持器官組織的相對(duì)完整性，可用于重點(diǎn)觀察細(xì)間的聯(lián)-系、排列情況和相互影響，以及局部環(huán)境的生物調(diào)節(jié)作用。