Western Blot 即免疫印跡試驗，可以利用 Western Blot 來比較在不同條件下，不同細胞組織中目的蛋白表達量的差異，屬于定性，半定量試驗。既然有差異性比較，參照物*。Western Blot 試驗中的標準（表達量）參照物即內參，有了參照物才能準確地比較目的蛋白表達量的差異。內參一般選用管家基因表達的蛋白，它們在各個組織細胞中表達相對恒定，不會因為外部條件變化而引起表達量的變化。而且內參可以監(jiān)測整個試驗體系是否正常，比如蛋白提取過程，轉膜體系，顯色體系等。

beta Actin、beta Tubulin、GAPDH、Lamin B1、PCNA 等已作為成熟的內參運用到試驗中，下面就大致介紹下如何選擇內參：

樣本來源

● 如果是哺乳動物的組織或細胞，主要以 beta Actin、beta Tubulin、GAPDH、Lamin B1、PCNA 為代表；

● 如果是植物樣本，主要以 actin、Rubisco 為代表。

目的蛋白定位

● 全細胞蛋白和細胞質：beta Actin、beta Tubulin、GAPDH 等；

● 細胞核蛋白: PCNA 等；

● 核膜蛋白：Lamin B1 等；

● 胞膜蛋白：Na(+)/K(+) ATPase 等。

目的蛋白分子量

beta Actin、beta Tubulin、GAPDH 的分子量分別是 42kd，50kd，37kd，目的蛋白分子量能與內參蛋白分子量相差 5kd 以上，才能分開目的蛋白和內參，寫文章做圖也更美觀；

三大內參

beta Actin，肌動蛋白，細胞骨架蛋白。它們在各組織和細胞中的表達相對恒定，在檢測蛋白的表達水平變化時常用它來做參照物。beta Actin 作為內參是得到*的，針對大多數(shù)組織和細胞來說的，它廣泛分布于細胞質內，表達量非常豐富。但是在一些少量特殊的情況下比如脂肪組織和細胞內，beta Actin 的表達量就很少。

GAPDH，甘油醛-3-磷酸脫氫酶，該酶是糖酵解反應中的一個酶，幾乎在所有組織細胞中都高水平表達，在同種細胞或組織中的表達量一般是恒定的，且很少受外部誘導物的影響。但比如缺氧和糖尿病等疾病存在下，會增加 GAPDH 在特定細胞和組織中的表達。

beta Tubulin，微管蛋白，細胞骨架蛋白。作為內參抗體，beta Tubulin 表達通常不會發(fā)生改變，因此被廣泛用于 Western Blot 內參，也常被用于免疫染色觀察細胞的微管結構。

下面是在開發(fā)抗體時的一點心得，希望對大家有幫助。

1. 不同的內參在選擇上也要根據(jù)具體的樣本情況選擇，沒有一種內參能適用所有的組織和細胞樣本。比如，血紅細胞（因為其細胞結構的特殊性和需要攜帶氧氣的功能性）樣本就不適合以上 3 種常用內參。如果使用會導致結果很差或者沒有結果?？梢赃x用血紅細胞的結構性蛋白作為內參代替。


2. 在做多組織多細胞樣本對比表達量時，選用 GAPDH 作為內參，因為 GAPDH 是代謝類蛋白，在活組織中表達比較恒定。而 beta Actin 和 beta Tubulin 是結構蛋白，不同組織的細胞結構會有差異性，如腦組織的 tubulin 的表達會高一些（因為神經細胞的軸突和樹突都由 tubulin 維持結構），而 actin 的表達量可能會低一些。再比如，骨骼肌、心肌和平滑肌的特殊功能反而導致了 tubulin 的表達改變和特化。心肌的 beta Actin 的表達量可能變少，而 alpha Actin 表達量高。因為這些組織的差異，現(xiàn)在慢慢采用總 Actin 和總 tubulin 作為內參，可以盡量減少一些組織表達量差異。

3. 做各種分泌液樣本的時候，如血漿，乳汁，組織液等，以上的 3 種內參也不是很合適。由于沒有完整的細胞結構，所以只能選擇一些分泌蛋白作為內參，或者采用其他方式作為內參。

4. 做誘導后樣本或檢測磷酸化等修飾性抗體時，選擇結構蛋白作為內參，如 beta Actin 和 beta Tubulin。因為 GAPDH 是代謝類蛋白，表達量有可能會受到誘導處理的影響。同時，做修飾性抗體的 Western Blot 實驗，也帶上同抗原的總抗作為陽性對照。

5. 做 Western Blot 實驗時，內參的條帶強度也要適當控制。不要讓內參條帶發(fā)生過度曝光的情況，尤其是用 X 膠片曝光的。如果內參條帶過度曝光，條帶會顯得很寬，妨礙對條帶正確強度的判讀，進而影響對其他實驗結果的判斷。的內參結果是： 窄窄的，黑色實心條帶。