1、取5×TBE緩沖液20ml加水至200ml，配制成0.5×TBE稀釋緩沖液，待用。

2、膠液的制備：稱取0.4g瓊脂糖，置于200ml錐形瓶中，加入50ml 0.5×TBE稀釋緩沖液，放入微波爐里(或電爐上)加熱至瓊脂糖全部熔化，取出搖勻，此為0.8%瓊脂糖凝膠液。加熱過(guò)程中要不時(shí)搖動(dòng)，使附于瓶壁上的瓊脂糖顆粒進(jìn)入溶液。加熱時(shí)應(yīng)蓋上封口膜，以減少水份蒸發(fā)。

3、膠板的制備：將有機(jī)玻璃膠槽兩端分別用橡皮膏(寬約1cm)緊密封住。將封好的膠槽置于水平支持物上，插上樣品梳子，注意觀察梳子齒下緣應(yīng)與膠槽底面保持1mm左右的間隙。

向冷卻至50-60℃的瓊脂糖膠液中加入溴化乙錠(EB)溶液使其終濃度為0.5μg /ml(也可不把EB加入凝膠中，而是電泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色)。用移液器吸取少量融化的瓊脂糖凝膠封橡皮膏內(nèi)側(cè)，待瓊脂糖溶液凝固后將剩余的瓊脂糖小心地倒入膠槽內(nèi)，使膠液形成均勻的膠層。倒膠時(shí)的溫度不可太低，否則凝固不均勻，速度也不可太快，否則容易出現(xiàn)氣泡。待膠*凝固后撥出梳子，注意不要損傷梳底部的凝膠，然后向槽內(nèi)加入0.5×TBE稀釋緩沖液至液面恰好沒(méi)過(guò)膠板上表面。因邊緣效應(yīng)樣品槽附近會(huì)有一些隆起，阻礙緩沖液進(jìn)入樣品槽中，所以要注意保證樣品槽中應(yīng)注滿緩沖液。

4、加樣：取10μl酶解液與2μl 6×載樣液混勻，用微量移液槍小心加入樣品槽中。若DNA含量偏低，則可依上述比例增加上樣量，但總體積不可超過(guò)樣品槽容量。每加完一個(gè)樣品要更換tip頭，以防止互相污染，注意上樣時(shí)要小心操作，避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞磕z刺穿。

5、電泳：加完樣后，合上電泳槽蓋，立即接通電源?？刂齐妷罕３衷?0-80V，電流在40mA以上。當(dāng)溴酚藍(lán)條帶移動(dòng)到距凝膠前沿約2cm時(shí)，停止電泳。

6、染色：未加EB的膠板在電泳完畢后移入0.5μg/ml的EB溶液中，室溫下染色20-25分鐘。

7、觀察和拍照：在波長(zhǎng)為254nm的長(zhǎng)波長(zhǎng)紫外燈下觀察染色后的或已加有EB的電泳膠板。DNA存在處顯示出肉眼可辨的桔紅色熒光條帶。紫光燈下觀察時(shí)應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡或有機(jī)玻璃面罩，以免損傷眼睛。 經(jīng)照相機(jī)鏡頭加上近攝鏡片和紅色濾光片后將相機(jī)固定于照相架上，采用全色膠片，光圈5.6，曝光時(shí)間10-120秒(根據(jù)熒光條帶的深淺選擇)。

8、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：在放大的電泳照片上，以樣品槽為起點(diǎn)，用卡尺測(cè)量λDNA的EcoRⅠ和HindⅢ酶切片段的遷移距離，以厘米為單位。以核苷酸數(shù)的常用對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，以遷移距離為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出連結(jié)各點(diǎn)的平滑曲線，即為該電泳條件下DNA分子量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

9、DNA酶切片段大小的測(cè)定：在放大的電泳照片上，用卡尺量出DNA樣品各片段的遷移距離，根據(jù)此數(shù)值，在DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的對(duì)數(shù)值，進(jìn)一步計(jì)算出各片段的分子量大小(若用單對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙來(lái)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，則可根據(jù)遷移距離直接查出DNA片段的大小)。反之，若已知DNA片段的大小亦可由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出它預(yù)計(jì)的遷移距離。

10、DNA酶切片段排列順序的確定：根據(jù)單酶切，雙酶切和多酶切的電泳分析結(jié)果，對(duì)照DNA酶切片段大小的數(shù)據(jù)進(jìn)行邏輯推理，然后確定各酶切片段的排列順序和各酶切位點(diǎn)的相對(duì)位置。以環(huán)狀圖或直線圖表示，即成該DNA分子的限制性內(nèi)切酶圖譜。