一、實驗?zāi)康?/p>

1.掌握聚合酶鏈式反應(yīng)的原理。

2. 掌握移液槍和PCR儀的基本操作技術(shù)。

二、實驗原理

PCR技術(shù)，即聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是由美國PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年獲諾貝爾化學獎）建立的。這項技術(shù)可在試管內(nèi)的經(jīng)數(shù)小時反應(yīng)就將特定的DNA片段擴增數(shù)百萬倍，這種迅速獲取大量單一核酸片段的技術(shù)在分子生物學研究中具有舉足輕重的意義，極大地推動了生命科學的研究進展。它不僅是DNA分析常用的技術(shù)，而且在DNA重組與表達、基因結(jié)構(gòu)分析和功能檢測中具有重要的應(yīng)用價值。

PCR可以被認為是與發(fā)生在細胞內(nèi)的DNA復制過程相似的技術(shù)，其結(jié)果都是以原來的DNA為模板產(chǎn)生新的互補DNA片段。細胞中DNA的復制是一個非常復雜的過程。參與復制的有多種因素。PCR是在試管中進行的DNA復制反應(yīng)，基本原理與細胞內(nèi)DNA復制相似，但反應(yīng)體系相對較簡單。

PCR由變性--退火--延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)做準備；

②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合；

③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在Taq酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈。

重復循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘， 2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

三、實驗試劑與器材

模板DNA、2.5mmol/L dNTP

Taq DNA聚合酶（5U/μL）、SSR引物

10 ×buffer、15mmol/L Mg2+、ddH2O

PCR儀、移液槍、PCR板

四、實驗步驟

1、配制20μL反應(yīng)體系，在PCR板中依次加入下列溶液：

模板DNA    2μL

引物1      1μL

引物2      1μL

dNTP      1.5μL

MgCl2        2μL

10×buffer    2μL

ddH2O      10μL

Taq酶      0.5μL

2、設(shè)置PCR反應(yīng)程序。

3、上樣，啟動反應(yīng)程序。

4、擴增產(chǎn)物的電泳檢測。

附PCR技術(shù)應(yīng)用

1、生命科學 a、人類基因組計劃 隨著的PCR日臻完善，科學家于2003年在完成的人類基因組“工作框架圖”的基礎(chǔ)上，經(jīng)過整理、分類和排列后得到的更加準確、清晰、完整的基因組圖譜。這是對人類基因組基本面貌的揭示，表明科學家們開始部分“讀”出人類生命“天書”所蘊涵的內(nèi)容。 b、后基因組計劃 人類基因組DNA序列圖譜完成后，鑒定基因組多態(tài)性及其單倍型以及尋找其在生物和醫(yī)學應(yīng)用中重要成為人們關(guān)心的熱點。以研究基因功能為核心的“后基因組時代”已經(jīng)來臨，大規(guī)模的結(jié)構(gòu)基因組、蛋白質(zhì)組以及藥物基因組的研究計劃已經(jīng)成為新的熱點。 c、物種的分類、進化及親緣關(guān)系 可以進行物種進化的保守性分析及物種多態(tài)性分析、物種鑒定。

2、醫(yī)藥 a、疾病的診斷和治療 遺傳性疾?。喝绲刂泻Ｘ氀?、鐮刀狀細胞貧血、凝血因子缺乏等有遺傳傾向的疾病，尤其是老年性疾病，如糖尿病、高血脂癥、甚至腫瘤中的一部分，均可預測；癌基因的檢測和診斷：檢測惡性腫瘤的標記物來診斷癌癥等疾?。焕没蛑委煼椒ㄖ委熌[瘤性疾病。 b、致病病原體的檢測 檢測范圍包括細菌、病毒（SARS及禽liu感病毒H5N1等）、原蟲及寄生蟲、霉菌、立克次體、衣原體和支原體等一切微生物。檢測的靈敏度和特異性都遠高于當前的免疫學方法，所需時間也已達到臨床要求，這對于難于培養(yǎng)的病毒（乙肝），細菌（如結(jié)核、厭氧菌）和原蟲（如梅毒螺旋體）等來說尤為適用。 c、DNA指紋、個體識別（DNA身fen證）、親子關(guān)系鑒別和法醫(yī)物證 可以用一根頭發(fā)、一個細胞、一個jing子來完成上述工作，這一領(lǐng)域也已發(fā)展到骨髓或臟器移植配型。 d、生物工程制藥 許多藥物可通過工程菌和細胞來大量生產(chǎn)，如干擾素、白介素、促紅細胞生長素等藥物。 e、轉(zhuǎn)基因動物制藥及疾病模型 轉(zhuǎn)基因動物與醫(yī)學及生物醫(yī)藥研究的關(guān)系越來越密切。近年來,各種人類疾病轉(zhuǎn)基因動物模型不斷建立。如轉(zhuǎn)基因動物在遺傳病、心血管疾病、腫瘤、高血壓病、病毒性疾病、異種移植、輸血醫(yī)學、藥理學研究中的應(yīng)用；利用轉(zhuǎn)基因動物-ru腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥物蛋白,好比在動物身上建“藥廠”,可以從動物乳汁中*地獲得具有穩(wěn)定生物活性的基因產(chǎn)品。這是一種全新的藥物生產(chǎn)模式,具有投資成本低,藥物研制周期短和經(jīng)濟效益高等優(yōu)點。

3、農(nóng)業(yè)科學 a、轉(zhuǎn)基因植物 按其功能主要分提高產(chǎn)量、抗病力、抗除草劑、改良品質(zhì)和發(fā)育調(diào)節(jié)。如:大豆、玉米、馬鈴薯、番茄等。 b、轉(zhuǎn)基因動物 在農(nóng)業(yè)方面，主要在改良畜禽生產(chǎn)性狀,提高畜禽抗病力及利用轉(zhuǎn)基因畜禽生產(chǎn)非常規(guī)畜產(chǎn)品。

4、考古學及歷史事件解讀利用人類短串聯(lián)重復STR-PCR技術(shù)，研究人類種族的遺傳多態(tài)性，效果非常穩(wěn)定。目前此技術(shù)已廣泛用于生物考古、種系發(fā)育、民族學、人類學和考古學等各個領(lǐng)域中。

5、衛(wèi)生安全 a、食品微生物的檢測 傳統(tǒng)的致病菌檢測首先經(jīng)過長時間的培養(yǎng)，費時費力，應(yīng)用PCR技術(shù)則非常迅速、準確。主要用于：食品致病菌的檢測，如肉毒唆菌等；乳酸菌的檢測；水中細菌指標測定。 b、轉(zhuǎn)基因食品的檢測 目前世界轉(zhuǎn)基因食品已經(jīng)有100多物種，大多數(shù)已經(jīng)用于食品。轉(zhuǎn)基因食品對人體健康的危害及對生態(tài)的影響也日受世界廣泛的重視，因此對轉(zhuǎn)基因食品的檢測成為控制其泛濫的一種手段。 c、動、植物檢疫　靈敏、特異、快速診斷檢測方法是我國進出口口岸的門衛(wèi)，檢查出入的人員、動、植物（種畜、種籽）等是否攜帶烈性傳染病（艾滋、動物病毒、植物病毒等）病原體，食品、飼料等是否帶沙門氏菌等均需要基因診斷手段將這些病菌拒之于之外，是提高我國綜合國力的必要保證。