細胞線粒體分離試劑盒使用說明書
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中文名：細胞線粒體分離試劑盒
供應商：上海遠慕
規(guī)格：50T
分類：細胞組分分離
保存：—20℃,12個月
說明：快速分離動物硬組織(如骨骼肌)中的線粒體的試劑盒
用途：分離線粒體的同時可以獲得去除線粒體的細胞漿蛋白,可用于分析細胞色素C等線粒體蛋白向胞漿的釋放,大部分獲得的線粒體都含有完整的內(nèi)膜和外膜,并具有線粒體的生理功能(如檢測線粒體膜電位),獲得的蛋白可用于SDS-PAGE、Western、雙向電泳等蛋白分析。
適用范圍：限于科研實驗，不作臨床
細胞線粒體分離試劑盒使用說明：
1、如果不是用于制備線粒體蛋白樣品，線粒體分離試劑和線粒體裂解液中不必加入PMSF。
2、如果用于制備線粒體蛋白樣品，線粒體分離試劑和線粒體裂解液中需添加PMSF。PMSF一定要在線粒體分離試劑或線粒體裂解液加入到樣品中前2-3分鐘內(nèi)加入，以免PMSF在水溶液中很快失效。
3、如果不是用于制備線粒體蛋白，Mitochondria Lysis buffer和Wash buffer中不必加入PMSF。如果用于制備線粒體蛋白樣品，Mitochondria Lysis buffer和Wash buffer中需添加PMSF。
細胞線粒體分離試劑盒作用：
1、本試劑盒分離獲得的線粒體純度較高，并且絕大部分分離獲得的線粒體都含有完整的內(nèi)膜和外膜，并具有線粒體的生理功能。因此本試劑盒分離得到的線粒體可以用于線粒體的生理功能等方面的研究。
2、本試劑盒分離得到的線粒體也可以被試劑盒中的線粒體裂解液或其它適當裂解液裂解后用于SDS-PAGE、Western、雙向電泳等蛋白分析。
3、本試劑盒提供了線粒體制備過程中勻漿程度的重要判斷指標，即臺盼藍染色，使分離得到的線粒體的質(zhì)量更加有保證。臺盼藍染色液為選用試劑，在實驗條件成熟后可以不必使用。
4、本試劑盒提供了蛋白酶抑制劑PMSF，使勻漿時蛋白酶的活性被適當抑制，這樣在獲得線粒體的同時還可以獲得有時有用的去除了大量線粒體的蛋白，在進行蛋白或酶活分析時可以作為對照。 如果每個樣品的細胞數(shù)量為2000-5000萬，本試劑盒可以處理50-100個樣品。
5、本試劑盒提供臺盼藍染色液和PMSF，可以分別判斷線粒體質(zhì)量和提取細胞漿蛋白。
細胞線粒體分離試劑盒實驗步驟：
1，清洗：用預冷的PBS清洗細胞，離心，其上清。
2，裂解：沉淀用預冷的Mitochondria Lysis buffer重懸細胞，冰浴放置，可用相差顯微鏡檢測膨脹的程度。
3，勻漿：把細胞懸液轉(zhuǎn)移至Dounce勻漿器中，勻漿10～20次。不同細胞或不同勻漿器所需的勻漿次數(shù)有所不同，需自行優(yōu)化。
4，臺盼藍染色(可選)：取約細胞勻漿液，加入30～50μl Trypan Blue Stain，混勻，顯微鏡觀察臺盼藍染色陽性(藍色)細胞的比例，如果陽性細胞比例不足50%，增加5次勻漿。
5，立即取勻漿液，加入等量Wash buffer，輕輕顛倒混勻數(shù)次。
6，離心以去除細胞核、未破碎的細胞和大的膜碎片。
7，上清液轉(zhuǎn)移至一干凈離心管，離心。
8，棄上清，沉淀為線粒體，如果希望獲得去除線粒體的細胞漿蛋白，應在本步驟中收集上清，并且在收集上清時注意勿觸及沉淀。
9，保存：棄上清，用適當緩沖液懸浮沉淀。
細胞線粒體分離試劑盒優(yōu)點：
1，專一性強
2，靈敏度高
3，樣品易保存
4，結(jié)果易觀察
5，可以定量測定
6，可以大規(guī)模測定樣品
7，儀器和試劑簡單
細胞線粒體分離試劑盒注意事項：
1，分離線粒體的所有步驟均需在冰上或4℃進行，所用溶液需冰浴或4℃預冷！全部操作 時間盡量控制在1h以內(nèi)；
2，通常在分離線粒體時前后兩次離心速度選取600g和11,000g，如果希望純度更高，但對線粒體的得率要求不高，前后兩次離心速度可以采用1000g和3500g；
3，避免直接接觸終止液和底物。如不小心接觸到這些液體，請盡快用水沖洗；
4，臺盼藍與PMSF對人體有毒，請注意小心防護；
5，實驗中不要吃喝、抽煙或使用化妝品；
6，試劑對于不同實驗不必全部使用，在實驗條件成熟后可以不必使用；
7，為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作；
8，本試劑盒請遠離兒童；
9，不要用嘴接觸試劑盒里的任何成份。
標簽：細胞線粒體分離試劑盒
