ELISA法檢測中應(yīng)注意的哪些問題？
ELISA法特異性強 ,敏感性高 ,操作快速簡便 ,因而是免疫學檢驗中zui為常用的方法 ,也是我們基層醫(yī)院檢驗科免疫學檢驗的主要技術(shù)手段。我科乙肝五項、丙肝抗體、HIV抗體、梅毒抗體等均用ELISA法檢測。其中HBsAg的檢測量zui大。我們在實際工作中體會到ELISA法檢測的全程質(zhì)量控制很重要 ,的試劑、良好的儀器和正確的操作是保證ELISA檢測結(jié)果準確可靠的必要條件?，F(xiàn)將我們平時在操作中認為需要重視的步驟及遇到的一些問題報告如下 :
1 標本的采集和保存
一般在醫(yī)學免疫檢驗中均以血清作為檢測標本。血清標本可按常規(guī)方法采集 ,應(yīng)注意避免溶血 ,因紅細胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質(zhì) ,以HRP為標記的 ELISA測定中 ,溶血標本可能會增加非特異性顯色。血清標本宜在新鮮時檢測。如有細菌污染 ,菌體中可能含有內(nèi)源性HRP,也會產(chǎn)生假陽性反應(yīng)。標本儲存時間過長,IgG可聚合成多聚體 ,在間接ELISA測定中導(dǎo)致本底過深 ,甚至造成假陽性。一般說來,在5天內(nèi)測定的血清標本可放置于4℃,超過1周測定的需低溫冰存。
2 試劑的準備
按試劑盒說明書的要求準備實驗中需用的試劑。ELISA中用的蒸餾水或去離子水 ,包括用于洗滌的 ,應(yīng)為新鮮的和高質(zhì)量的。從冰箱中取出的試驗用試劑應(yīng)待溫度與室溫平衡后使用。試劑盒中本次試驗不需用的部分應(yīng)及時放回冰箱保存。
3 加樣
在ELISA中一般有3次加樣步聚,即加標本,加酶結(jié)合物,加底物。加樣時應(yīng)將所加物加在ELEISA板孔的底部,避免加在孔壁上部 ,并注意不可濺出 ,不可產(chǎn)生氣泡。加標本一般用微量加樣器 ,按規(guī)定的量加入板孔中。每次加標本應(yīng)更換吸嘴,以免發(fā)生交叉污染。需用稀釋的血清,可在試管中按規(guī)定的稀釋度稀釋后再加樣。也可在板孔中加入稀釋液,再在其中加入血清標本 ,然后在微型震蕩器上震蕩1min以保證混和。加酶結(jié)合物應(yīng)用液和底物應(yīng)用液時可用定量多道加液器 ,使加液過程迅速完成。
4 保溫
在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應(yīng) ,即加標本和加酶結(jié)合物后?？乖贵w反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時間。ELISA屬固相免疫測定,抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。以抗體包被的夾心法為例加入板孔中的標本,其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結(jié)合的機會 ,只有zui貼近孔壁的一層溶液中抗原直接與抗體接觸。這是一個逐步平衡的過程,因此需經(jīng)擴散才能達到反應(yīng)的終點。在其后加入的酶標·記抗體與固相抗原的結(jié)合也同樣如此。這就是為什么ELISA反應(yīng)總是需要一定時間的溫育ELISA法一般均采用37℃水浴,可將ELISA板底置于水浴箱中,使溫度迅速平衡。為避免蒸發(fā),一定要用封板條封住反應(yīng)孔。若用保溫箱, ELISA板應(yīng)放在濕盒內(nèi),在盒底墊濕的紗布,zui后將ELISA板放在濕紗布上。無論是水浴還是濕盒溫育 ,反應(yīng)板均不宜疊放 ,以保證各板的溫度都能迅速平衡。應(yīng)注意溫育的溫度和時間應(yīng)按規(guī)定力求準確。
5 洗滌
洗滌在ELISA過程中雖不是一個反應(yīng)步驟,但卻也決定著實驗的成敗。ELISIA就是靠洗滌來達到分離游離的和結(jié)合的酶標記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì),以在反應(yīng)過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的,而在洗滌時又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來。可以說在ELISA操作中,洗滌是zui主要的關(guān)鍵技術(shù),應(yīng)引起操作者的高度重視?，F(xiàn)將我們在洗板中遇到的幾個問題歸納如下:
5. 1血液凝固不全引起的假陽性血液凝固不全時有纖維吸附現(xiàn)象,致使洗板不凈,殘留的非固相酶產(chǎn)生的非特異性顯色影響結(jié)果,而且這種顯色很深易誤認為強陽性。據(jù)統(tǒng)計,我們對12例這種現(xiàn)象的陽性結(jié)果進行重新分離血清再測定,結(jié)果其中有10例為陰性,2例為真陽性,且乙肝五項1例為大三陽1例為小三陽。所以在洗板完畢，拍板時要注意觀察孔內(nèi)是否有纖維蛋白原吸附現(xiàn)象,因此而出現(xiàn)的陽性應(yīng)重新復(fù)查。
5. 2 洗液要臨用前新鮮配制,放置時間過長易產(chǎn)生絮狀物或混濁,造成賭孔或花板。
5. 3 洗板時間我科使用上海榮盛公司提供的 EL ISA檢測HBsAg的試劑 ,說明書介紹洗滌5次,間隔5 s～15s進行洗板。經(jīng)過長期實驗摸索,我們改為洗滌6次,間隔30s,這樣可避免洗滌不凈而引起的假陽性。我們曾做過對比試驗:84份血清標本以上述兩種洗板方法分別測定HBsAg,結(jié)果5次15s有2例陽性 , 3例弱陽性,而6次30s洗板有1例陽性其為陰性。后經(jīng)五項指標檢查只有同時陽性的1例為大三陽;2例抗 2HBs陽性其余指標陰性,故不支持 HBsAg陽性結(jié)果,是由于洗板不凈而引起的假陽性。
6 比色與結(jié)果判定應(yīng)注意的問題
顯色后一定要在規(guī)定時間內(nèi)進行比色。判讀結(jié)果不能僅用目測 ,一定要用酶標儀測定 ,上酶標儀要注意板條各孔中比色液體積的一致,否則會產(chǎn)生誤差。我們曾做過對比試驗:取清潔板條24孔每孔加蒸餾水100ul,用博賽2010型酶標儀,波長450測定其吸光度,均值A(chǔ) =0. 015,取出板條每孔補加蒸餾水50 ul及蒸餾水150 ul,同條件下測定其吸光度,均值A(chǔ)= 0.009,結(jié)果孔內(nèi)100 ul體積的吸光度顯著高于 150ul體積,原因是比色液體積較少即液面較低與孔內(nèi)壁的折光較強而使吸光度增高。故測定中應(yīng)注意滴加顯色劑及終止液的量。
